Stimulering af differentieringen af ​​knogleprækursorer med organisk modificeret hydroxyapatit (ormoHAP) nanosfærer

Bioinspirerede materialer efterligner deres naturlige modstykker for karakteristisk funktionalitet i multidisciplinære applikationer, der danner et populært tema i udvikling af biomaterialer. I knoglevævsteknik, for eksempel, forskere fokuserer på den naturlige sammensatte arkitektur af knogler, organisk designet ud fra komplekse strukturer af mineraliseret kollagen. De resulterende biokonstruerede konstruktioner inkluderer uorganiske/organiske kompositter baseret på native pattedyrknoglekomponenter såsom kulsyreholdig apatit og kollagen. Imidlertid, mikropartikelinkorporering i materialekonstruktioner kan forårsage komplikationer under for tidlig in vivo resorberbarhed, på grund af deres sprøde natur.

I en nylig undersøgelse, nu udgivet i Biomedicinske materialer, IOP Videnskab , Christiane Heinemann og medarbejdere ved Max Bergmann Center of Biomaterials og Institute of Materials Science i Tyskland, konstruerede isolerede nanosfærer ved hjælp af organisk modificeret hydroxyapatit (ormoHAP) - for at danne et sammensat stillads, der er på linje med tidligere arbejde fra det samme forskerhold. Heinemann et al. konstruerede det nye biomateriale ved hjælp af en elektrisk felt-assisteret ion-dobbelt migrationsproces og indlejrede de således dannede nanosfærer, i skummet gelatine organisk skabelon, at danne det sammensatte stillads.

Forskerne testede biomaterialernes bionedbrydningshastigheder for at vise, at de korrelerede med graden af ​​tværbinding (40 %, 80%) transporteret under klargøring af stilladser og med mineralindholdet i stilladserne (0%, 20 %, 40 %). De brugte en human celle co-kultur model af osteoblaster og osteoklaster afledt af knoglemarvs stromaceller og monocytter, at teste virkningen af ​​ormoHAP-gelatine stilladser på cellevækst og differentiering i en periode på 42 dage.

Resultaterne bekræftede, at ormoHAP indlejret i gelatinematrixen øgede TRAP5b bioaktivitet (tartrat-resistent sur phosphatase 5b); en gruppe enzymer syntetiseret i knogler, efterfulgt af øget ALP-aktivitet (alkalisk fosfatase, en osteoblastmarkør) og øget genekspression af BSPII (knoglesialoprotein II - der koder for et væsentligt strukturelt protein i knoglematrixen) i osteoblaster. Forskerne foreslog en sekvens af celle-krydstale-interaktioner, på grund af tilstedeværelsen og koncentrationen af ​​ormoHAP i materialet, at forklare den observerede adfærd i celle co-kulturer in vitro.

Hydroxyapatit (HAP) nanokrystallerne samles selv i det organiske miljø for at danne hule sfæriske agglomerater i eksperimenterne, som forskerne først karakteriserede i dybden på grund af deres rolle i dannelsen af ​​knogleerstatningsmaterialerne (BSM). Heinemann et al. valgte gelatine som det underliggende stilladsmatrixmateriale på grund af dets kompatibilitet med den elektriske feltassisterede mineraldannelsesproces af nanosfærer, mens begge bestanddele af kompositten (HAP og gelatine) viste cytokompatibilitet under celle-materiale interaktioner som vist i tidligere undersøgelser in vitro.

Gelatine er en velegnet bestanddel til at danne bioinspirerede materialer til knoglevævskonstruktion, da det er et denatureringsprodukt af kollagen, med rigelig tilgængelighed, bearbejdelighed, bionedbrydning og lav antigenicitet; velegnet til at udvikle nye biomaterialer. Materialeforskere udviklede tidligere lignende konstruktioner som gelatine/alginat, gelatine/chitosan, gelatine/βTCP eller gelatine/HAP komposit stilladser, hvor mineraliserede kompositter lettede celleproliferation sammenlignet med monofasiske substrater. In vitro eksperimenter med co-kulturer af forskellige celletyper er bedre egnede til at teste biomaterialer, da de repræsenterer de naturlige betingelser for intercellulær interaktion for at simulere celleregenerering.

For mere præcist at replikere betingelserne in vivo , Heinemann et al. tidligere gennemført kosttilskudsfrie co-kulturer med osteoblaster og osteoklaster for at teste biomaterialer under materiale-assisteret knogleregenerering. Arbejdet indikerede kravet om afbalanceret krydstale mellem knogledannende osteoblaster og knogleresorberende osteoklaster enten via opløselige faktorer eller direkte celle-cellekontakt. til effektiv knogleombygning.

Forskerne forenede derfor resultaterne af mange tidligere undersøgelser i dette arbejde, at bestemme dannelsen af ​​knoglevævslignende ekstracellulære matrixaflejringer styret af det underliggende biomateriale. Heinemann et al. co-dyrkede humane knoglemarvsstromale celler (hBMSC) med humane osteoblaster (hOB), og humane monocytter (hMc) med humane osteoklaster (hOC), uden tilskud på 3D komposit (ormoHAP/Gelatine) stilladser. De udførte derefter cellemateriale karakteriseringer (test) for at undersøge indflydelsen af ​​de organisk modificerede HAP nanosfærer (ormoHAP) på celleadfærd og interaktioner i laboratoriet.

Forskerne konstruerede først en række kompositter med ormoHAP indlejret i gelatine for at skabe flere stilladser til cellekultureksperimenter, efterfulgt af at teste dem med scanning elektronmikroskopi (SEM) billeder for at forstå mikro-/nano-arkitekturen af ​​det nye materiale. De observerede distinkt overflademønster på gelatinematrixen på grund af homogen ormoHAP-fordeling. Heinemann et al. producerede en række af sådanne stabile stilladser på kemisk tværbundne gelatine-organiske skabeloner og testede deres nedbrydningsadfærd ved hjælp af buffer (phosphatbufret saltvand, PBS) eller simuleret kropsvæske (SBF) medier for nøje at efterligne in vivo biologiske forhold i laboratoriet.

Forskerne bestemte virkningerne af procentdelen af ​​gelatine-tværbinding og koncentrationen af ​​ormoHAP på bioaktiviteten og nedbrydningen af ​​det nye materiale, med sammenlignende undersøgelser. I nedbrydningsstudier med SBF eller PBS, stilladser med en lavere grad af tværbinding nedbrydes meget hurtigere, end dem med højere tværbinding. På dag 56, forskerne observerede højere niveauer af bioaktivitet på stilladser med 20 procent ormoHAP; bestemmes ved at kvantificere niveauerne af overfladebundet calcium. Selvom en koncentration på 40 procent ormoHAP viste lovende resultater oprindeligt, værdierne af overfladebundet calcium faldt med tiden.

Under co-kultur eksperimenter Heinemann et al. sammenlignede derfor to forskellige koncentrationer af ormoHAP (20 procent og 40 procent), ved siden af ​​stilladser lavet af ren gelatine alene. Forskerne gennemførte strategisk cellekulturstudier fra dag 14 til dag 28 og frem til dag 42, derefter ved hjælp af DNA-analyse kvantificerede de cellekernerne og beregnede celleproliferationshastigheden for at vurdere det samlede antal celler på materialets overflader, uden nogen signifikant forskel observeret mellem overfladerne.

De kvantificerede ALP-aktivitet, at vurdere osteogen differentiering i monokultur og co-kultur, som faldt efter 14 dage, efterhånden som cellemodningen steg. For at undersøge differentieringen af ​​hMc til hOB i co-kultur, forskerne kvantificerede TRAP5b-aktivitet, som steg bemærkelsesværdigt med stigende ormoHAP-indhold i stilladssammensætningen til materiale-assisteret cellevækst. På dag 42 faldt hastighederne af enzymaktivitet imidlertid på grund af osteoklastcellernes begrænsede levetid. Heinemann et al. derefter udført konfokal laser scanning mikroskopi (cLSM) billeddannelse for at undersøge samkultur interaktioner på stilladset.

De observerede celle-co-kulturerne, der viste grønt aktinskelet, blå cellekerner ved hjælp af fluorescerende makere og brugte en rød celleoverfladeantigenmarkør (CD68) til at påvise monocytter (hMc). Ved hjælp af mikroskopiske billeder, forskerne observerede varierende cellemorfologi fra spindelform til sfærisk form, detaljeret hvordan celler interagerer med det underliggende nye materiale. De opdagede TRAP, som lysplettede grønne pletter, i stigende grad koncentreret i celler, efterhånden som ormoHAP-niveauerne på materialets overflade steg, for at fremhæve effekten af ​​materiale-assisteret cellevækst. Heinemann et al. til sidst udførte genanalyse for at bestemme opreguleringen af ​​specifikke markører relateret til celledifferentiering ved hjælp af kvantitativ real-time polymerase kædereaktion (qRT-PCR).

De undersøgte især BSPII (knoglematrix-kodende protein), RANKL (receptoraktivator af NF-KB-ligand) involveret i knoglemodellering/remodellering og osteoklastfremstilleren OSCAR (osteoklastassocieret Ig-lignende receptor), der resorberer knogle - afgørende for knoglehomeostase. Resultaterne viste opregulering af BPSII og OSCAR, verifikation af materiale-assisteret celledifferentiering i dette arbejde.

På denne måde Heinemann et al. omfattende karakteriserede celle-materiale interaktioner for at forstå de nye, bioinspirerede ormoHAP-materialer under biofunktionalisering. De viste indflydelsen af ​​den nye stilladsgeometri på knogledannende og resorberende celler, og på intercellulære interaktioner med hinanden, ved hjælp af celle-samkulturstudiet. Resultaterne vil give videnskabsmanden mulighed for at opnå optimerede produktionsbetingelser for yderligere at forbedre og udvikle materialekonstruktioner til bioinspireret materialeteknik. Den øgede koncentration af ormoHAP i stilladserne stimulerede cellulær krydstale mellem osteoblaster og osteoklaster, som det fremgår af specifikke markører for genopregulering, med lovende implikationer for yderligere undersøgelser af de nye materialer inden for knoglevævsteknik.

© 2019 Science X Network