Hævning af væske omkring levende celler

Cellekulturplader, der er til daglig brug i biologi, kan effektivt omdannes til mikrofluidiske enheder, åbne veje for biologer til at minimere cellebaserede arbejdsgange. I en nylig rapport, Ph.d. forsker Cristian Soitu og kolleger i afdelingerne for ingeniørvidenskab og patologi ved University of Oxford, Oxford, Storbritannien, beskrevet en enkel metode til at skabe mikrofluidiske arrangementer omkring celler. I undersøgelsen, cellerne voksede allerede på standard petriskåleoverflader, da forskerne brugte grænsefladen mellem de ikke -blandbare flydende medier i beholderen som et byggemateriale.

De omformulerede de konventionelle cellekulturretter til sofistikerede mikrofluidiske enheder efter behov ved at omforme væskestrukturer omkring levende celler. Soitu beskriver den nye væskeformningsteknik, som hans forskerhold har bygget, som "væskestrukturer for de celler med frygt for engagement, når de vælger et hjem-de kan let fjernes og nye (med en anden geometri) bygges på plads." Forskningen er nu offentliggjort den Videnskab fremskridt

Forskerne demonstrerede metoden ved hjælp af arbejdsgange, der involverer cellekloning; selektiv kloning af en specifik klon blandt andre i en skål; medicinsk behandling; og sårheling. Forskningsarbejdet viste en alsidig tilgang, koblet til biologisk venlige funktioner for at fremme mikrofluidik -teknologien blandt biologer. Mikrofluidikbaserede tilgange har vundet popularitet i mange arbejdsgange, selvom deres optagelse inden for almindelig biologi fortsat er langsom på grund af forskellige årsager, inklusive:

1. Materiel uforenelighed til cellevækst
2. Mikrofluidiske arkitekturer, der er lukkede og utilgængelige
3. Forudbestemte geometrier, der ikke kan omkonfigureres under forsøg - hvilket medfører omkostninger ved fremstilling og drift
4. Arbejdsgange designet af ingeniører, der ikke er i overensstemmelse med allerede eksisterende teknikker udviklet af biologer.

I fortiden, forskere skabte 3D-konstruktioner med flydende vægge på nanoskalaen, selvom deres biokompatibilitet stadig skal vurderes. I det nuværende arbejde, derfor, Soitu et al. udviklet en metode til at lave arrays af isolerede mikrofluidiske kamre på jomfruelige petriskåle til at rumme store arbejdsgange i cellebiologi. Mulige eksempler omfatter cellefodring og overførsel, kloning, kryokonservering, fiksering og immunolabeling, cellelyse og revers transkriptionspolymerasekædereaktion (RT-PCR) og CRISPR-Cas9 genredigering. I tidligere forsøg med sådanne arbejdsgange tilføjede forskere cellerne efter fremstilling af mikrofluidik.

I det nuværende arbejde, forskerne oprettede en række mikrofluidiske arrangementer på standard petriskåle indeholdende vedhæftende celler og omkonfigurerede dem i realtid. De isolerede og hentede cellekloner for at udføre proof-of-concept-lægemiddeltest og sårhelingsassays og introducerede den nye teknik til at oprette og omkonfigurere mikrofluidiske kredsløb på petriskåle, mens celler voksede og delte sig, med mange potentielle anvendelser inden for mainstream biologi.

Den nye teknik og proof-of-concept-eksperimenterne

I de efterfølgende forsøg, forskerne dækkede først bunden af ​​en petriskål med vævskulturmedium og fjernede det meste af mediet for at danne en tynd film, der dækkede polystyrensubstratet. De lagde den tynde film over med et ikke -blandbart fluorcarbon (FC40) for at forhindre fordampning og som en barriere mod eksterne forurenende stoffer for at opretholde sterilitet af mediet. Brug derefter et teflonspids, forskerne kontaktede bunden af ​​fadet, forskydning af den vandige fase til dannelse af mikrofluidiske arrangementer i form af interesse - i dette tilfælde, en firkant. Ved hjælp af teknikken, forskerne bragte fordelene ved den åbne mikrofluidiske platform til standard cellekultur-ware.

Soitu et al. formede den vandige fase til at skabe et gitter med lave mængder væske som tidligere demonstreret af det samme team, og så dem med selektive farvestoffer i selektive kamre. For eksempel, perifere kamre modtog et blåt farvestof (der dannede en blå firkant), og dem i det indre dannede ordet "OXFORD".

Forskerne "trykte" en cirkel inden for en trekant inden for en firkant og brugte mikroliter af tre farvestoffer til separat at se de tre former; hvor FC40 forhindrede farvestofferne i at blande sig. Resultaterne viste evne til at bygge og ødelægge FC40-vægge for effektivt at begrænse væskerne i enhver ønsket 2-D-form.

Efter de foreløbige proof-of-concept resultater, Soitu et al. genererede arrays af kamre for at rekapitulere kloning af musetumorceller (NM18), som de oprindeligt oprettede net, efterfulgt af celleaddition derefter. Forskerne lod først cellerne vokse frit omgivet af FC40 -væggen, der var gennemtrængelig for både O ₂ og CO ₂ , og derefter ved at vokse enkelte celler til kloner, før de omgiver dem med flydende vægge af forskellige former.

De viste, at væskevægge med forskellige 2-D-fodaftryk let kunne bygges omkring levende celler, så længe kolonierne forblev isolerede fra hinanden under efterfølgende behandling eller genfinding. Tidligere undersøgelser, der voksede celler inden for begrænsede, præmønstrede overflader krævede overfladebehandling før celleadhæsion-hvilket bidrager til den bemærkelsesværdige undtagelse i den foreliggende teknik.

Ansøgninger i klonplukning og lægemiddeltest

I det næste trin, forskerne lavede en referenceplade, hvorpå de anbragte et fad indeholdende levende cellekolonier for at isolere cellekloner af interesse fra andre ved at udskrive væskevægge omkring dem. På isolation, de kunne vælge kolonierne, gendanne cellerne og dyrke dem konventionelt til at formere sig som forventet. Da væskevæggene effektivt kunne begrænse væskerne, Soitu et al. testet deres effektivitet ved at tilføje puromycin - en lille molekyle -translatorhæmmer, der dræber pattedyrsceller.

I den eksperimentelle opsætning af lægemiddelscreening, de tillod det centrale kammer at modtage vækstmedium alene, mens stoffet blev leveret til de omgivende kamre i en høj dødelig dosis, for at vise effektiviteten af ​​FC40 -separation, når kun cellelinierne i det centrale kammer overlevede. I et andet eksempel, Soitu et al. udnyttet ejendommen af ​​en human embryonisk nyrecellelinie, der er genetisk modificeret til at kode et grønt fluorescerende promotorgen. Som tændte i nærvær af tumornekrosefaktor-α til fluorescerende grøn. Væskevæggene dannede effektive barrierer for lægemiddeleksponering, verificering af teknikens potentiale for screening af lægemidler.

Ansøgninger i sårheling

De gennemførte også proof-of-princip sårhelingsassays ved at bruge en enkelt skål belagt på to forskellige måder, at overvåge to sårhelingsbetingelser. For det, forskerne brugte Matrigel - et gelatinøst protein udskilt af sarkomceller og fibronectin - et glycoprotein i den ekstracellulære matrix, der forbedrede sårheling. De tilføjede HEK -celler, der dannede et monolag i fadene og skabte et "sår" ved at trække teflonspidsen hen over monolaget, når celler vandrede ind i sårene med lidt forskellige hastigheder. Selvom Soitu et al. overfladebehandlet overfladen før udpladning af celler, de kunne også ændre belægningsteknikken for dens tilføjelse, efter at cellerne begyndte at migrere ind i de nydannede sår for at fremme heling.

På denne måde, Cristian Soitu og kolleger udviklede en fleksibel, mikrofluid platform til miniaturisering af arbejdsgange i cellebiologi. De udvidede teknikken i det foreliggende arbejde til at danne mikrofluidiske arrangementer omkring præpletterede vedhæftende celler efterfulgt af en række forskellige principper om principper for cellekloning, lægemiddelscreening og sårheling. Platformen har mange fordele og kan erstatte den konventionelle tilstand med præfabrikerede mikrofluidiske enheder som et fleksibelt og tilpasseligt alternativ. De nye mikrofluidiske arrangementer bidrager omkostningseffektivt til nøjsom videnskab og kan omkonfigureres i realtid under et eksperiment for ekstra alsidighed. Forskerne noterer begrænsninger ved teknikken, inklusive 2-D begrænsede arrangementer og skrøbelighed af væskevægge i forhold til faste vægge. Soitu et al. håber at optimere og kombinere disse funktioner og fordele for at tilbyde en ny platform for almindelige biologer til at udforske mikrofluidikernes kraft.

© 2019 Science X Network