Isolering af intakte bakterier fra blod ved hjælp af en mikrofluidisk monolitanordning

Nye enkeltcellediagnostik er afhængige af potentialet til hurtigt og effektivt at isolere bakterier fra komplekse biologiske matricer. I en nylig undersøgelse offentliggjort i Mikrosystemer og nanoteknik , Jung Y. Han og kolleger ved de tværfaglige afdelinger for maskinteknik, Chemical Biomolecular Engineering og Bioengineering i USA udviklede en enhed til at isolere intakte og levedygtige bakterier fra fuldblod ved hjælp af en mikrofluidik, porøs silica monolit. De opnåede mekanisk hæmolyse, mens de sørgede for passage af intakte og levedygtige bakterier gennem monolitterne til størrelsesbaseret bakteriel isolering og selektiv lysis. Han et al. beskrev en proces til at syntetisere store mængder af diskrete kapillarbundne monolitelementer og millimeterskala monolit-klodser for at integrere i mikrofluidchips.

De undersøgte virkningen af ​​monolitisk morfologi, geometri og strømningsbetingelser på cellelyse og strømningsregimer, der tillod selektiv cellelyse og selektiv passage af multiple gramnegative og grampositive bakterier. Teknikken anvendt af Han et al. tillod hurtig prøveforberedelse og bakteriel analyse i kombination med enkeltcellet Raman-spektrometri. Arbejdet giver unikke prøveforberedelsestrin til at understøtte hurtig og kulturfri bakteriel analyse til anvendelser i point-of-care biomedicinsk udstyr.

Bakterier i blodet kan føre til sepsis, infektion af væv og andre alvorlige medicinske tilstande, kræver tidlig identifikation af blodbårne bakterier for effektiv behandling. Evnen til hurtigt at identificere bakterier ved hjælp af point-of-care diagnostik kan i høj grad øge det kliniske potentiale for optimal behandling under tidlig infektion. Den eksisterende guldstandard for bakteriel karakterisering er baseret på fænotypisk cellekulturanalyse og kræver mindst 24 timer at indsamle prøver til kultur og analyse i et diagnostisk og klinisk mikrobiologilaboratorium. Den eksisterende teknik er robust og billig, men kan ikke generere rettidige resultater til at guide de indledende behandlingsstadier.

I nærværende arbejde, Han et al. udforsket mikrofluidiske enheder integreret med porøse silica monolitter som simple gennemstrømningselementer til selektiv blodcelleanalyse og intakt isolering af bakterier. Monolitter er meget porøse materialer sammensat af åben celle morfologi med snoede veje af væskestrøm. Forskere kan kontrollere monolitisk poremorfologi via høj mekanisk overfladespænding under celleperfusion til mekanisk hæmolyse af blodceller, mens de tillader intakte og levedygtige bakterier at rejse de snoede strømningsveje for deres kulturfri isolering. Han et al. brugt tilgangen til selektiv passage for bakterier i fuldblod under strømningsbetingelser for gram-positive og gram-negative arter, trods forskelle i bakteriestammerne. Teknikken med high-throughput selektiv monolit lysis kombineret med kraftfulde analytiske metoder såsom Raman spektroskopi kan tillade dyrkningsfri analyse af bakterier i fuldblod på niveau med den enkelte celle.

Han et al. modificerede tidligere rapporterede silica monolit synteseprocesser, efterfulgt af hydrolyse og kondensation af silica til dannelse af silicaglas ved lave temperaturer. For at forberede silicamonolitten, forskerne brugte en forstadieopløsning sammensat af alkylsilicater, polyethylenglycol (PEG) som porogen, urinstof som en kilde til hydroxylioner for at minimere heterogenitet og eddikesyre. Da de optimerede den syntetiske proces, de resulterende monolitter var homogene og godt forankret til silicakapillærvæggene. Forskerne målte tykkelsen af ​​den endelige skeletmonolitstruktur og beregnede dens permeabilitet ved hjælp af højtydende væskekromatografi til at kontrollere eksperimentelle forhold. For at minimere iboende variation, Han et al. skær de resulterende kapillarrør i 5 cm lange segmenter for at teste permeabilitet før brug.

De udviklede derefter to komplementære metoder til lav- og højkapacitetsdrift for at integrere silicamonoliter i mikrofluidiske systemer. For at tillade lav gennemstrømning, forskerne indlejrede monolitholdige kapillarsegmenter i termoplastiske mikrofluidiske chips for at beskytte monolitten under integrationen. Til selektiv lysis med høj gennemstrømning brugte de monolitter med større tværsnitsarealer i de mikrofluidiske enheder. Den komplette fremstillingsmetode gav fremragende pålidelighed til lækagefri drift under fuldblodsperfusion.

Som bevis på princippet, Han et al. udvalgte Enterobacter cloacae (gram-negativ, stavformede bakterier) for at undersøge deres effektivitet ved passage, sammen med tre gram-positive bakterier; Lactococcus lactis, Micrococcus luteus og Bacillus subtilis. Under eksperimenterne de perfunderede bakterielle opløsninger gennem de mikrofluidiske monolitter med varierende geometri og strømningsbetingelser for at teste passage af bakterier og blodcellelyse ved hjælp af dynamisk lysspredning (DLS). For eksempel, perfusionen af ​​oprenset E. cloacae gennem monolitten gav ikke mærkbare ændringer i DLS-toppene, indikerer intakt passage af bakterier.

Forskerne viste effekten af ​​længden af ​​den porøse monolit enhed på effektiviteten af ​​røde blodlegemer (RBC). Resultaterne indikerede, at RBC-lyseeffektiviteten steg signifikant for monolitlængder over 1 mm. Han et al. undersøgte også skæbnen for hvide blodlegemer (WBC'er) under drift af monolitindretningen, cellerne kunne ikke passere gennem monolitten uden at blive lyseret svarende til røde blodlegemer. Teknisk set, RBC'er deformeres til en diskot form for at passere gennem monolit, hvilket forårsagede signifikant øget membranspænding til at resultere i RBC-lyse. Forholdsvis, bakterieceller havde samme dimensioner som monolitporerne og krævede derfor mindre cellevægsudvidelse for vellykket passage uden brud. Forskerne optimerede enhedens parametre til forskellige bakterier for at tolerere høje niveauer af membranstress uden at gå i stykker. Yderligere udvikling sikrede intakt passage af bakterier uden nedbrydning og med levedygtighed.

Til bakteriel passage med høj gennemstrømning, forskerne fortyndede blodet i kapillæranordningerne. Imidlertid, som et alternativ, de kunne også udvide monolittenes kapacitet til fuldblodslysis. Enhederne behandlede mere end 400 µL fuldblod fyldt med bakterier, før de udviste en betydelig stigning i modtryk, på grund af tilstopning som følge af cellelyse og også på grund af intakte leukocytter (WBC'er) fanget i den porøse matrix.

For at lokalisere målbakterier, Han et al. opnåede en prøve afsat på et objektglas, efter at den passerede gennem monolit-processen. De udførte enkeltcellet Raman-analyse ved manuelt at scanne den optiske probe på tværs af prøven. De forventer brugen af ​​selektiv lyseringsteknologi, koblet til konfokal Raman-mikroskopi i fremtiden for at forbedre processen med at detektere bakteriestammer af interesse ved lave koncentrationer på et defineret sted af interesse.

På denne måde Jung Y. Han og hans kolleger udviklede en mikrofluidisk monolit til effektivt at isolere intakte bakterier med vidtgående termanostik, point-of-care potentiale til kliniske anvendelser. De forestiller sig foreningen af ​​konfokale Raman-mikroskopiværktøjer, der i øjeblikket stort set er begrænset til forskningslaboratoriet med nye miniaturiserede og håndholdte systemer for at bane vejen mod hurtige og bærbare point-of-care-enheder.

© 2019 Science X Network