Beskyttelse af DNA-origami til levering af lægemidler mod kræft

Forskere har designet og syntetiseret kæder af molekyler med en præcis sekvens og længde for effektivt at beskytte 3-D DNA nanostrukturer mod strukturel nedbrydning under en række biomedicinsk relevante forhold. De demonstrerede, hvordan disse "peptoid-coatede DNA-origami" har potentialet til at blive brugt til at levere anti-cancer-lægemidler og proteiner, billeddannelse af biologiske molekyler, og målretning af celleoverfladereceptorer impliceret i cancer. Deres metode til at designe peptoider til at stabilisere DNA-origami i fysiologiske miljøer er beskrevet i et papir offentliggjort i Proceedings of the National Academy of Sciences ugen den 9. mar.

Svarende til den japanske kunst at folde papir, DNA-origami er foldningen af ​​lange, fleksible DNA-kæder til ønskede former på nanoskala (milliarddele af en meter) ved at "hæfte" forskellige dele af kæden med de komplementære basepar af korte DNA-strenge. Disse programmerbare og præcist kontrollerede nanoskalaarkitekturer kan være gavnlige for mange biomedicinske applikationer, herunder målrettet levering af lægemidler og gener til ønskede væv eller celler, billeddannelse af biologiske processer inde i kroppen, og biosensing til sygdomsdetektion eller sundhedsovervågning. Imidlertid, at muliggøre sådanne applikationer vil kræve løsninger til at beskytte DNA-origami-strukturer i komplekse biologiske væsker og muliggøre nye funktioner, der ikke er iboende til DNA.

"En af de begrænsende faktorer ved at anvende struktur- og formfordelene ved DNA-origami til nanomedicin er, at placeret inde i menneskekroppen, DNA-nanostrukturen ville let blive fordøjet af enzymer eller nedbrydes som reaktion på ændringer i opløsningens sammensætning eller pH-niveau, " forklarede første forfatter Shih-Ting (Christine) Wang, en postdoc i Soft and Bio Nanomaterials Group i Center for Functional Nanomaterials (CFN) ved US Department of Energy's (DOE) Brookhaven National Laboratory. "I denne undersøgelse, vi syntetiserede biokompatible molekyler kaldet peptoider med en veldefineret molekylær sekvenssammensætning og længde. Vi har coatet oktaedrisk-formet DNA-origami - som har høj mekanisk stabilitet og et stort åbent rum til at transportere nanoskala last såsom små molekyle anti-cancer lægemidler - med disse peptoider. Vores demonstrationer viste, at peptoid-belægningerne effektivt beskyttede DNA-origamien under forskellige fysiologiske forhold og understøttede tilføjelsen af ​​forskellige kemiske funktionaliteter til biomedicinske anvendelser."

Peptoider ligner peptider, eller korte kæder af aminosyrer. Imidlertid, i peptoider, sidekæderne (kemiske grupper knyttet til hovedkæden eller rygraden af ​​molekylet) er knyttet til nitrogen i stedet for til kulstof. I øvrigt, peptoider er mere fleksible, på grund af manglen på hydrogenbindinger i rygraden. Denne fleksibilitet kan udnyttes til at kontrollere, hvordan peptoiderne binder til DNA-origamien.

"Vores mål var at lave en minimalistisk belægning, der ikke ville tilføje bulk til origamien, men samtidig være effektiv nok til at tilbyde beskyttelse, opløselighed, og kompatibilitet med forskellige biofunktioner, " sagde den tilsvarende forfatter Oleg Gang, leder af CFN Soft and Bio Nanomaterials Group og professor i kemiteknik og anvendt fysik og materialevidenskab ved Columbia Engineering. "Hvis den belagte origami bliver omfangsrig, dens form og hvordan den interagerer med og rummer andre biomolekyler og origami ville blive påvirket, introducerer en række komplikationer."

Wang og Gang, assisteret af en samarbejdspartner fra Imperial College London, brugte faciliteter på Lawrence Berkeley National Laboratory's Molecular Foundry (MF) til at syntetisere to slags peptoidarkitekturer til beskyttelse af DNA-origami:børstetype og bloktype. Begge arkitekturer har et DNA-bindende domæne (positivt ladet del, der binder til det negativt ladede DNA) og et vandopløseligt domæne (del, der sikrer, at DNA er omgivet af vandmolekyler, som er nødvendige for stabilisering). Børstearkitekturen veksler mellem disse to domæner, mens bloktype-arkitekturen grupperer dem for at danne distinkte "blokke".

For at afgøre, hvilken type der var bedre til at yde beskyttelse, forskerne undersøgte bindingen mellem tostrenget (dupleks) DNA og peptoider. Eksperimenter med fluorescerende farvestof (som binder til DNA'et) viste, at en specifik børste-type arkitektur var mest effektiv til at stabilisere duplex DNA coatet med peptoider ved høj temperatur. En samarbejdspartner ved RMIT University i Australien simulerede DNA-peptoid-interaktioner på molekylært niveau for at forstå hvorfor.

"Vi tror på, at den vekslende struktur opnår en balance, ved at nogle stykker sidder i rillen af ​​DNA-dobbelthelix-strukturen for at give beskyttelse, mens andre stykker stikker ud for at interagere positivt med vand, " sagde Wang. "En optimal konfiguration er børstetypen med 12 DNA-bindende og 12 vandopløselige grupper."

Styret af disse undersøgelser, holdet undersøgte den strukturelle stabilitet af den peptoid-coatede DNA-origami under flere typer fysiologisk relevante forhold:i en opløsning indeholdende en lav koncentration af positivt ladede magnesium (Mg) ioner, i en opløsning indeholdende en DNA-specifik nuklease (type enzym), og inkuberet i cellekulturmedier (indeholdende både nukleaser og Mg-ioner i lav koncentration). Typisk, en høj Mg-ion-koncentration er nødvendig for at stabilisere DNA-origami ved at reducere frastødningen af ​​DNA-DNA-negative ladninger, men fysiologiske væsker indeholder meget lavere koncentrationer.

Til deres undersøgelser, de brugte en kombination af eksperimentelle teknikker:agarosegelelektroforese, en fremgangsmåde til adskillelse af DNA-fragmenter (eller andre makromolekyler) på basis af deres ladning og størrelse; transmissionselektronmikroskopi-billeddannelse og dynamisk lysspredning ved CFN; og real-time småvinklet røntgenspredning ved Life Science X-ray Scattering (LiX) beamline af Brookhavens National Synchrotron Light Source II (NSLS-II). Resultaterne indikerede, at origamiens struktur var forblevet intakt, efter at den var blevet belagt med specifikt designede peptoider og anbragt under de forskellige fysiologiske forhold.

Efter disse eksperimenter, forskerne gennemførte en række demonstrationer i samarbejde med Bertozzi Group ved Stanford University for at udforske, hvordan den peptoid-coatede origami kunne bruges i biomedicinske applikationer. For eksempel, de fyldte kemoterapimidlet doxorubicin i den coatede origami. Doxorubicin er et af de almindeligt administrerede lægemidler til patienter med HER2-positiv brystkræft, hvor en overekspression af HER2-proteinet (en receptor på brystceller) får celler til at dele sig og vokse ukontrolleret. Over 48 timer, den coatede origami frigav mindre af doxorubicin end dens ikke-coatede modstykke, som målt gennem intensiteten af ​​lægemidlets iboende fluorescens.

"Det ultimative mål er at være i stand til at modulere frigivelseshastigheden under lægemiddelleveringsprocessen for at kontrollere biologiske og toksiske effekter, " forklarede Wang.

I en anden nanocargo-demonstration, de undersøgte, om proteiner kunne leveres på en lignende måde. De indkapslede et ko-afledt protein (bundet til fluorescerende molekyler til visualisering) inde i den coatede origami i nærvær af det proteinfordøjende enzym trypsin. Fordøjelsen af ​​dette indkapslede protein med trypsin blev reduceret og bremset på grund af en kombination af selve DNA-origamien og peptoidcoatingen.

I en sidste demonstration, de funktionaliserede overfladen af ​​den peptoid-coatede DNA-origami med trastuzumab. Mere almindeligt kendt under varemærket Herceptin, trastuzumab er et antistof, der retter sig mod HER2-receptorer. Ved binding til disse receptorer, trastuzumab blokerer kræftcellerne i at modtage de kemiske signaler, de har brug for for at vokse. De opnåede overfladefunktionaliseringen ved at tilføje kemiske grupper til specifikke steder på trastuzumab-molekylet og ind i peptoidsekvenserne. Gennem "klikkemi, Disse grupper reagerer selektivt for at danne kovalente bindinger (svarende til at klikke på et selespænde).

I opfølgende eksperimenter, Wang planlægger at udforske potentialet ved kombinatorisk terapi, hvor peptoid-coatet DNA-origami, der bærer doxorubicin og med en trastuzumab-funktionaliseret overflade, målretter mod HER2-positive brystkræftceller.

Wang blev tildelt midler gennem Brookhavens Technology Maturation Program til at videreudvikle denne teknologi på baggrund af et pitch, hun udviklede som deltager i den anden iværksættertræningsworkshop arrangeret af Brookhavens Office of Technology Transfer i april 2019. Brookhavens Intellectual Property Legal Group indsendte for nylig en foreløbig patentansøgning for peptoiddesignmetoden til US Patent and Trademark Office.

"Vi bevæger os nu ind i den translationelle fase, udfører eksperimenter med celler og potentielt hele organismer, " sagde Gang.