Forskere udvikler et økonomisk værktøj til at lette identifikation af sygdomsfremkaldende patogener

SMU-nanoteknologiekspert MinJun Kim hjalp et team af forskere ved University of Texas i Austin med at udvikle en billigere måde at detektere nukleasefordøjelse på - et af de kritiske trin i mange nukleinsyresensing-applikationer, såsom dem, der bruges til at identificere COVID-19.

Nukleinsyrepåvisning er den primære metode til at identificere patogener, der forårsager infektionssygdomme. Da millioner af PCR-tests blev kørt over hele verden hver dag under COVID-19-pandemien, er det vigtigt at reducere omkostningerne ved disse tests.

En undersøgelse offentliggjort i tidsskriftet Nature Nanotechnology viser, at dette billige værktøj, kaldet Subak, er effektivt til at fortælle, hvornår nukleasefordøjelse har fundet sted, hvilket er når et enzym kaldet nuklease nedbryder nukleinsyrer, såsom DNA eller RNA, til mindre fragmenter.

Den traditionelle måde at identificere nukleaseaktivitet på, Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) sonde, koster 62 gange mere at producere end Subak-reporteren.

"Subak-reporter er mere omkostningseffektiv og enklere end FRET-baserede systemer, og tilbyder en alternativ metode til at detektere nukleaseaktivitet," sagde Kim, Robert C. Womack-stolen ved Lyle School of Engineering ved SMU og hovedefterforsker af BAST Lab . "Mange nukleinsyredetektionsmetoder i dag, såsom PCR og DETECTR, er stadig afhængige af brugen af ​​FRET-prober i deres sidste trin."

I modsætning til PCR er DETECTR (DNA endonuklease-målrettet CRISPR trans reporter) en lettere analyse eller test, der er afhængig af CRISPR-Cas nuklease til patogen DNA-detektion. Kim og forskerne ved UT Austin har med succes erstattet FRET-sonden med Subak-reporter i DETECTR-analysen, hvilket har reduceret analyseomkostningerne væsentligt.

Subak-reportere er baseret på en særlig klasse af, hvad der er kendt som fluorescerende sølv nanoclusters. De består af 13 sølvatomer viklet rundt om en kort DNA-streng - et organisk/uorganisk sammensat nanomateriale, der er for lille til at være synligt med det blotte øje og varierer i størrelse fra 1 til 3 nanometer (en milliardtedel af en meter) i størrelse .

Nanomaterialer i denne længdeskala kan være meget selvlysende, såsom kvanteprikker, og udvise forskellige farver. Fluorescerende nanomaterialer har fundet anvendelse i tv-skærme og i biosensing, såsom Subak-reporteren.

Ledende forsker Tim Yeh, en lektor i biomedicinsk teknik ved Cockrell School of Engineering ved UT Austin, og hans team programmerede Subak-reporterne til at udsende en anden farve, når de fordøjes af nukleaser.

"Disse DNA-skabelonede sølv nanoclusters udsender oprindeligt grøn fluorescens, men gennemgår et bemærkelsesværdigt farveskift til lyse rødt, når DNA fragmenteres af nukleaser," sagde Kim. "Farveændringen hos Subak-reportere er let synlig under en UV-lampe," selvom selve enheden er minimal.

Subak-reportere koster kun $1 pr. nanomolekyle at lave. I modsætning hertil koster FRET - som kræver brug af forskellige fluorescerende farvestoffer, der kræver mere for at få resultater - $62 pr. nanomolekyle at producere, sagde Kim.

Kim og Madhav L. Ghimire, SMU's dekan's postdoc-stipendiat ved SMU's Moody School of Graduate and Advanced Studies, arbejdede sammen med Yeh for at optimere og karakterisere DNA/AgNC sølv nanoclusterne. Dette omfattede at øge intensiteten af ​​den grønne og røde fluorescens før og efter fragmentering af nukleaser.

Karakterisering involverede bekræftelse af størrelsen, strukturen og stabiliteten af ​​nanoclusterne i specifikke miljøer.

"Optimering af disse billige detektorer er afgørende for at overvåge deres fluorescensegenskaber, sikre nanoclusters stabilitet, kontrollerende størrelse og struktur, og vigtigst af alt for at forbedre deres følsomhed og selektivitet under forskellige miljøforhold, hvilket gør dem mere pålidelige til sanseformålet," Ghimire sagde.

Udover yderligere test af Subak-reporteren til nukleasefordøjelse, ønsker holdet også at undersøge, om det kan være en sonde for andre biologiske mål.

Flere oplysninger: Hong, S. et al., En ikke-FRET DNA-reporter, der ændrer fluorescensfarve ved nukleasefordøjelse. Naturenanoteknologi (2024). DOI:10.1038/s41565-024-01612-6

Leveret af Southern Methodist University