Brug af molekylære cookie cutters til at se membranproteinorganisation

Membranen, der omslutter en biologisk celle, er ikke blot en barriere; det er propfyldt med proteiner involveret i alle mulige kritiske biologiske funktioner. For virkelig at forstå, hvad membranproteiner gør og hvordan, skal forskere vide, hvordan de er organiseret, og hvordan de interagerer med hinanden. Men det er udfordrende at afdække den information.

Yale-forskere har nu udviklet en ny mikroskopimetode kaldet Native-nanoBleach, der overvinder de største udfordringer med at forstå membranproteinorganisation, herunder vanskeligheden ved at studere disse membraner uden at forstyrre det oprindelige miljø og grænser for opløsningen af ​​lysmikroskoper, der typisk bruges til at studere dem.

Og for at demonstrere effektiviteten af ​​den nye metode, anvendte de den med succes på en biologisk gåde – vedrørende proteiner involveret i udviklingen af ​​kræft i bugspytkirtlen, og hvordan de kan målrettes til behandling – som har været uløst i årtier.

De beskriver den nye metode og dens fordele i en ny undersøgelse offentliggjort i Nature Nanotechnology .

Metoder, der typisk anvendes i studiet af membranproteinorganisation, kræver at man fjerner det native membranmiljø, der omgiver proteiner og derefter placerer isolerede proteiner af interesse i miljøer, der efterligner, men ikke fuldt ud replikerer kompleksiteten af ​​den rigtige cellemembran, sagde Moitrayee Bhattacharyya, assisterende professor i farmakologi. på Yale School of Medicine og seniorforfatter af undersøgelsen. Denne tilgang, sagde Bhattacharyya, fjerner vigtig kontekst, eftersom proteinerne interagerer med de molekyler, der omgiver dem.

For det andet har lysmikroskoper, som almindeligvis bruges til at observere proteinorganisation, ikke den nødvendige opløsning til at afgøre, om proteiner i nærheden af ​​hinanden virkelig interagerer eller blot er naboer på membraner.

Sidst kan mængden af ​​et bestemt protein fundet i en cellemembran være for lav eller for høj til nuværende undersøgelsesmetoder. I disse tilfælde skal forskere foretage justeringer; de skal enten replikere proteiner, der i deres naturlige tilstand er for få i antal eller udskille proteiner fra prøver, hvor der er for mange. Men dette kan igen fjerne vigtig kontekst om den naturlige tilstand af proteiner, når de sidder og fungerer i cellemembraner.

"Ideelt set ville vi have en metode, der ville fungere med ethvert endogent niveau af cellemembranproteinekspression," sagde Bhattacharyya.

For at tackle den første udfordring brugte forskerne særlige molekyler, typer af polymerer, til i det væsentlige at udstanse proteinkomplekser med deres omgivende cellemembran intakt. "Det er som om cellemembranen er et ark kagedej, og polymererne er småkageudstikkere," sagde Bhattacharyya.

Disse bits af protein med omgivende cellemembran, kaldet native nanodiscs, er cirka 10 nanometer i diameter, små nok til, at alle proteiner indeholdt i nanoskiven sandsynligvis interagerer, hvilket løser den anden udfordring. Yderligere fungerer denne tilgang med ethvert cellemembranprotein i enhver mængde, hvilket gør det muligt for forskere at observere proteiner på deres naturlige niveauer i native membraner.

Når nanodiskene er genereret, kan forskere bruge et hvilket som helst antal almindeligt anvendte teknikker til at finpudse et bestemt protein af interesse. De kvantificerer derefter proteinerne i hver nanodisk ved hjælp af fluorescerende molekyler knyttet til dem.

Det er en tilgang, der tilbyder høj rumlig opløsning uden behov for specialiseret hardware, sagde Bhattacharyya.

"Dette arbejde præsenterer en ny teknik til at forstå, hvordan membranproteiner - som repræsenterer omkring 60% af lægemiddelmålene - samles i funktionelle enheder på eller inden for det native lipid-dobbeltlag," sagde Gerard Walker, medførsteforfatter af papiret og en kandidatstuderende. i Bhattacharyyas laboratorium.

For at demonstrere, hvordan denne metode kan anvendes, tog forskerne en årtier lang debat inden for biologi. Et protein kaldet KRas er muteret i mere end 90% af humane bugspytkirtelkræft, hvilket vækker enorm klinisk og terapeutisk interesse. Hvorvidt KRas-underenheder samles for at danne dimerer (to enheder) eller oligomerer (mere end to enheder) på cellemembraner, har været fokus på langvarig undersøgelse.

Undersøgelser har imidlertid frembragt modstridende resultater. Dyre- og cellulære undersøgelser, som mangler detaljeret molekylær opløsning, viser tegn på, at KRas-enheder kommer sammen på cellemembraner. I mellemtiden har biofysiske analyser, som ikke fastholder den native membran omkring proteiner, fundet KR'er-rester i enkelte enheder eller monomerer.

"Med vores metode får vi det bedste fra begge verdener," sagde Bhattacharyya. "Vi bevarer det native membranmiljø, og vi har meget høj rumlig opløsning og enkeltmolekyleopløsning. Da vi anvendte vores metode, fandt vi ud af, at KR'er eksisterer som dimerer og monomerer i lignende mængder. Men når KR'er er muteret, som i bugspytkirtelkræft, dimerer stigning og monomerer falder."

Fundet fremhæver vigtigheden af ​​den native cellemembran for at forstå membranproteiner og identificerer et mål - der reducerer KRas-dimerisering - for kræftbehandling. Dette er blot en af ​​mange måder, hvorpå denne metode kan bruges til at forstå rollen af ​​membranproteinorganisation i sygdom, sagde Bhattacharyya.

"Det er virkelig givende at se Native-nanoBleach allerede blive anvendt med succes til en lang række presserende biologiske spørgsmål i Bhattacharyya-laboratoriet og videre," sagde Caroline Brown, medførsteforfatter af undersøgelsen og en ph.d. kandidat i laboratoriet hos medforfatter Kallol Gupta, assisterende professor i cellebiologi.

Membranproteiner udgør en tredjedel af alle proteinerne i den menneskelige krop, og denne tilgang kan bruges til at studere enhver af dem, sagde Bhattacharyya.

"Det er en generel teknik," sagde hun. "Der er virkelig ingen begrænsning."

Fremadrettet håber Bhattacharyya og hendes kolleger at udvide denne tilgang til at studere proteinorganisation i membranerne af forskellige organeller, strukturer, såsom mitokondrier, der er indeholdt i celler.

Flere oplysninger: Gerard Walker et al., Oligomer organisering af membranproteiner fra native membraner ved rumlig og enkeltmolekylær opløsning på nanoskala, Nature Nanotechnology (2023). DOI:10.1038/s41565-023-01547-4

Journaloplysninger: Natur nanoteknologi

Leveret af Yale University