Lysere fluorescerende markører giver mulighed for finere billeddannelse

Forskere ved McKelvey School of Engineering ved Washington University i St. Louis har været banebrydende for en ny teknik, der vil muliggøre billeddannelse i højere opløsning af meget små objekter som neuroner. Teknikken, som forbedrer en eksisterende metode kaldet ekspansionsmikroskopi, er beskrevet i et nyt papir offentliggjort i tidsskriftet Nano Letters .

De fleste mennesker kender til mikroskoper, der bruger linser til at få en genstand til at virke større og lettere at se med det menneskelige øje. Men ekspansionsmikroskopi (ExM) fungerer praktisk talt på den modsatte måde - ved at gøre selve objektet større. Forskere belægger prøven - for eksempel en celle - med små lysemitterende markører kaldet fluoroforer, og indlejrer derefter prøven i en gel, der udvider sig, når den kommer i kontakt med vand. Efterhånden som prøven vokser sig større, sporer de fluorescerende etiketter konturerne af træk, der er for små til at se, såsom de tynde grene eller dendritter, der vokser fra hjerneceller.

Men ekspansionsmikroskopi har en stor mangel. Lyssignalet, der udsendes af konventionelle fluoroforer, mister meget af sin intensitet (mere end 50 %) under forberedelses- og ekspansionstrinnene.

"Når du gør tingene større, er det ikke nødvendigvis godt, for hvis du ikke ændrer mængden af ​​signal, der allerede er til stede, bliver det signal svagere," sagde Barani Raman, professor i biomedicinsk teknik.

Raman og Srikanth Singamaneni, Lilyan &E. Lisle Hughes-professoren ved Institut for Mekanisk Teknik og Materialevidenskab, har behandlet dette problem ved at bruge ultralyse fluorescerende markører kaldet plasmoniske fluorstoffer (PF'er). Singamaneni udviklede PF'erne til andre applikationer i 2020.

"Det er et godt eksempel på, at to mennesker med helt forskellig ekspertise har en tilfældig samtale og siger "Okay, dette problem er her på ét felt, men løsningen er der på et andet område," sagde Raman. Holdet har døbt sin nye teknik. "plasmonforstærket ekspansionsmikroskopi" eller p-ExM.

Plasmonisk-fluoren er konstrueret af en kernepartikel af guld pakket ind i en sølvskal, som derefter dækkes med et lag af andre materialer, inklusive konventionelle fluoroforer. Strukturen er designet til at beskytte fluoroforerne mod de skrappe kemikalier, der bruges i processen og for at gøre lyssignalet fra fluoroforerne meget lysere. Teknikken vil hjælpe forskere med at kortlægge neurale netværk eller forbindelserne mellem neuroner.

"Metalnanopartiklerne tjener som en antenne, hvilket betyder, at den er i stand til at trække mere lys ind i fluoroforerne," sagde Singamaneni. Samspillet mellem guld-sølv nanopartiklerne og fluoroforerne får også fluoroforerne til at udsende flere fotoner, end de normalt ville. Som et resultat er plasmonisk-fluor næsten fire størrelsesordener lysere, end de fluorescerende markører ville være alene. Plasmoniske fluorstoffer løser også problemet med signalfortynding, fordi de fluorescerende markører er knyttet direkte til nanopartiklerne, så de ikke spredes fra hinanden, når prøven udvider sig.

For at demonstrere potentialet ved plasmonforstærket ekspansionsmikroskopi brugte forskerne det til at studere en prøve af neuroner fra hippocampus-regionen af ​​hjernen. I nogle tilfælde er neuronens spirende grene, kaldet neuritter, for tæt på hinanden til at kunne ses uden hjælp fra teknikker som ekspansionsmikroskopi.

"Når to neuritter er for tæt på hinanden, kan vi ikke løse dem. Softwaren tror, ​​at de kun er en neurit," sagde Singamaneni.

Efter at have mærket cellerne med de ultralyse plasmoniske fluorstoffer og udvidet prøven, var holdet i stand til at tælle antallet af neuritter, kvantificere det samlede areal af neuritterne og måle længden af ​​individuelle neuritter. De identificerede 2,5 gange flere neuritterminale punkter, end de var synlige, før prøven blev udvidet.

Da holdet sammenlignede plasmonic-fluorens ydeevne med fluoroforerne af sig selv, fandt de ud af, at plasmonic-fluoren beholdt omkring 76 % af lyssignalet, mens fluoroforerne beholdt mindre end 16 %. Holdets resultater viste også, at plasmonforstærket ekspansionsmikroskopi er kompatibel med eksisterende ekspansionsmikroskopiprotokoller, hvilket betyder, at plasmoniske fluorstoffer kan bruges i stedet for konventionelle fluoroforer i fremtidige undersøgelser. PF'er kan også skabes ud fra enhver given fluorofor, der passer til forskeres behov.

Flere oplysninger: Priya Rathi et al., Plasmon-Enhanced Expansion Microscopy, Nano Letters (2023). DOI:10.1021/acs.nanolett.3c01256

Journaloplysninger: Nanobreve

Leveret af Washington University i St. Louis