Sådan beregnes RNA-koncentrationen

Kvantificer din RNA-prøve ved at måle absorbansen af ​​ultraviolet lys (UV). Et nano-drop spektrofotometer vil kun bruge en eller to mikroliter af din prøve, som du kan genoprette. Andre spektrofotometre kræver en meget større prøve. Udryddelseskoefficienten for nukleotider ved en UV-bølgelængde på 260 nm i en 1 cm lysvej er 20. Baseret på denne ekstinktionskoefficient er absorbansen af ​​40 μg /ml RNA under de samme betingelser en. Ved hjælp af disse oplysninger kan du beregne koncentrationen af ​​din RNA-prøve.

Foretag en fortynding, hvis det er nødvendigt, af din prøve. En standardfortynding for en mikrokuvette er 1:40. Foretag denne fortynding ved at tilsætte 2 μL RNA-prøve til 78 μL sterilt vand.

Følg protokollen for dit bestemte spektrofotometer for at kalibrere maskinen ved hjælp af et blanktryk og bestemm derefter den optiske densitet af din prøve ved en UV-bølgelængde på 260 nm.

Multiplicer absorbansen af ​​din prøve med din fortyndingsfaktor med 40 μg RNA /mL. Ligningen ville være: "RNA koncentration (μg /ml) = (OD260) x (fortyndingsfaktor) x (40 μg RNA /ml) /(1 OD260 enhed)" (Hofstra.edu) For eksempel: Hvis du fortyndede din prøve ved 1:40 og din absorbansaflæsning var 0,08, du ville gange 0,08 x 40 x 40 = 128 μg /ml = 0,13 μg /μL

Find ud af renheden af ​​din prøve ved at tage en anden absorbansaflæsning ved 280 nm UV-bølgelængde . Forholdet OD 260 /OD 280 vil indikere, om - og på hvilket niveau - din prøve er forurenet med protein eller phenol. Et resultat på 1,8 til 2,0 indikerer kvalitet RNA.

Tip

Glem ikke at kalibrere dit spektrofotometer. At køre en hurtig elektroforetisk gel bekræfter dine specifikke resultater.

Advarsel

Antag ikke, at din prøve er ren. Tager tid til et OD260 /OD280 forhold sparer tid og penge ned ad vejen.