Fordelene ved at bruge Sticky End Enzymer

Molekylær kloning er en fælles bioteknologimetode, som alle studerende og forskere skal være bekendt med. Molekylær kloning ved anvendelse af en type enzym kaldes et restriktionsenzym til at skære humant DNA i fragmenter, der derefter kan indsættes i plasmid DNA fra en bakteriel celle. Restriktionsenzymer skærer dobbeltstrenget DNA i halvdelen. Afhængigt af restriktionsenzymet kan skæringen resultere i enten en klæbrig ende eller en stump ende. Klæbende ender er mere nyttige i molekylær kloning, fordi de sikrer, at det humane DNA-fragment indsættes i plasmidet i den rigtige retning. Ligeringsprocessen eller fusion af DNA-fragmenter kræver mindre DNA, når DNA'et har klæbrige ender. Endelig kan flere klæbrige endebegrænsningsenzymer producere den samme klæbrige ende, selvom hvert enzym genkender en anden restriktionssekvens. Dette øger sandsynligheden for, at din DNA-region af interesse kan skæres ud af klæbende endezymer.

Restriktionsenzymer og restriktionssteder

Restriktionsenzymer er enzymer, der skærer genkende specifikke sekvenser på dobbeltstrenget DNA og skære DNA'et i halvdelen ved den sekvens. Den genkendte sekvens kaldes restriktionsstedet. Restriktionsenzymer kaldes endonukleaser, fordi de skærer dobbeltstrenget DNA, hvilket er, hvordan DNA normalt findes, på steder der ligger imellem DNA-enderne. Der er mere end 90 forskellige restriktionsenzymer. Hver anerkender et særligt restriktionssted. Restriktionsenzymer spalter deres respektive restriktionssteder 5.000 gange mere effektivt end andre steder, som de ikke genkender.

Den rigtige orientering

Restriktionsenzymer kommer i to generelle klasser. De skærer enten DNA i klæbrige ender eller stumme ender. En klæbrig ende har en kort region af nukleotider, byggestenene af DNA, der er upareret. Denne uparvede region kaldes et overhæng. Overhænget siges at være klæbrigt, fordi det vil og vil parre med en anden klæbrig ende, der har komplementær overhængssekvens. Sticky ender er som lange tabte tvillinger søger at kramme hinanden stramt, når de mødes. På den anden side er stumme ender ikke klæbrige, fordi alle nukleotiderne allerede er parret mellem de to tråde af DNA. Fordelen ved klæbrige ender er, at et fragment af humant DNA kun kan passe ind i et bakterielt plasmid i en retning. I modsætning hertil, hvis både det humane DNA og bakterieplasmidet har stumme ender, kan det humane DNA indsættes fra hoved til hale eller hale til hoved i plasmidet.

Ligating Sticky Ends kræver mindre DNA

Forskellige enzymer kan give den samme klæbrige ende

Restriktionssteder er placeret i hele organismenes genom, men er ikke ensartet fordelt. I plasmider kan de konstrueres til at være placeret lige ved siden af ​​hinanden. Forskere, der ønsker at skære et fragment af humant DNA fra det menneskelige genom, skal finde restriktionssteder, der er foran og bagud i fragmentets område. Ud over at sikre, at et DNA-fragment indsættes i den rigtige retning, kan forskellige klæbrige ende-enzymer skabe den samme klæbrige ende, selvom de genkender forskellige restriktionssekvenser. For eksempel har BamHI, BglII og Sau3A forskellige genkendelsessekvenser, men producerer den samme GATC klæbrige ende. Dette øger sandsynligheden for, at der vil være klæbrige endebegrænsningssteder, der flankerer dit menneskelige gen af ​​interesse