Undersøgelse af porerne i membranvesikler

Ionkanaler i membranvesiklerne, der medierer intracellulær proteintransport, spiller en afgørende rolle i cellefysiologien. En metode udviklet af et Ludwig-Maximilians-Universitaet (LMU) i München-team gør det nu muligt at studere dem med større specificitet end nogensinde før.

Små membranbundne vesikler, kendt som endosomer og lysosomer, tjene som køretøjer til transport af proteinladninger inden for dyreceller. Indlejret i vesikelmembranerne er proteiner kaldet ionkanaler, som styrer passage af elektrisk ladede atompartikler ('ioner') ind i og ud af disse intracellulære organeller. Defekter i disse proteiner spiller en central rolle i patogenesen af ​​mange sygdomme, og dissektion af deres molekylære funktioner er afgørende for udviklingen af ​​effektive terapier til disse lidelser. PD Christian Grimm og professor Christian Wahl-Schott fra Farmaceutisk Institut (direktør:Professor Martin Biel) ved LMU München er blandt Europas førende specialister i brugen af ​​den såkaldte patch-clamp teknik til undersøgelse af ionkanaler i cellemembraner . I det seneste nummer af tidsskriftet Naturprotokoller , de beskriver, hvordan de har tilpasset metoden til brug med endolysosomale vesikler. I en anden undersøgelse, offentliggjort i tidsskriftet Cell Chemical Biology, de viser videre, hvordan patch -fastspænding kan anvendes på bestemte funktionelle klasser af transportvesikler. Dette gennembrud åbner helt nye perspektiver for karakterisering af ionkanaler og de mekanismer, der regulerer dem.

Det endolysosomale system består af tre forskellige klasser af endosomer - tidligt, sent og genanvendelse af endosomer - samt lysosomer. Disse forskellige typer vesikler har forskellige funktioner. Tidlige endosomale vesikler dannes ved udfoldning af pletter på cellemembranen som reaktion på aktivering af f.eks. receptorproteiner ved hjælp af ekstracellulære signalmolekyler. Dette gør det muligt at fjerne receptorerne fra overfladen og løsrive sig fra deres aktiverende ligander. Receptorerne sendes derefter enten til genbrug af endosomer og returneres til cellemembranen, eller leveret til sene endosomer, der overfører dem til lysosomer, hvor de nedbrydes enzymatisk. Dette menneskehandel system deltager i talrige metaboliske processer og spiller en afgørende rolle i reguleringen af ​​tungmetalmetabolisme og i den korrekte lokalisering af specifikke membranreceptorer. De ionkanaler, der findes i vesikulære membraner, er intimt involveret i alle disse operationer. "Ifølge undersøgelser af deres proteinpopulationer, lysosomer og endosomer indeholder op til 70 forskellige ion-kanal transportproteiner, "Siger Grimm.

Patch-clamp-metoden gør det muligt at måle passagen af ​​ladede partikler gennem enkelte ionkanaler i membranplaster, og dermed at afgøre, om kanalen er aktiv eller inaktiv. For at gøre det, man trækker et lille stykke membran ind i en mikropipette ved at anvende svagt sug, således sikres, at der dannes en tæt forsegling mellem membranen og pipettens væg. Ved hjælp af en mikroelektrode, man kan derefter anvende en testspænding og føre strøm gennem alle ionkanaler, der er til stede i plasteret. "Problemet er, at i deres normale tilstand, vesikler er for små til at få adgang til via en patch -pipette, så de skal forstørres, før der kan foretages målinger, "siger Grimm. Dog, de farmakologiske værktøjer, der hidtil er blevet brugt til dette formål, virker vilkårligt på alle endolysosomale vesikeltyper. I et forsøg på at opdage mere specifikke agenter, LMU -forskerne screenede et bibliotek af forbindelser og identificerede en særlig kombination af to biologiske toksiner, der selektivt inducerer udvidelsen af ​​tidlige endosomer ved at få dem til at smelte sammen. Ud over, de var i stand til at demonstrere, at et tredje molekyle selektivt forstørrer sene endosomer og lysosomer. Især ingen af ​​disse stoffer virker på genbrug af endosomer.

"Dette repræsenterer et betydeligt fremskridt, fordi vi nu har to sæt værktøjer, der sætter os i stand til at anvende mere specifikke tilgange og spørge, hvilke kanaler der er aktive i hvilke typer vesikler, "Forklarer Grimm. Faktisk, han og hans kolleger har brugt de nye agenter til at vise, at den såkaldte TRPML3-ionkanal, som styrer passagen af ​​positivt ladede kationer og pH (surhedsgrad) i vesikler, er aktiv i både tidlige og sene endosomer og lysosomer. I modsætning, den relaterede TRPML1 -kanal findes i sene endosomer og lysosomer, men ikke i tidlige endosomer. Mutationer i TRPML -kanaler bidrager til patogenesen af ​​alvorlige medfødte tilstande, såsom mucolipidoser, en sjælden klasse af stofskiftesygdomme, der forringer nervesystemets funktion. "Takket være vores udvidelse af patch -fastspænding til intracellulære vesikler, vi kan nu adressere disse ionkanaler med større selektivitet. Dette er også vigtigt i søgen efter stoffer, der specifikt kan hæmme funktionerne i bestemte ionkanaler til terapeutiske formål, ”Påpeger Grimm.