Hvordan fremstilles rekombinant DNA?

Rekombinant DNA (deoxyribonukleinsyre er en syntetisk type nukleinsyre skabt ved at forbinde DNA-sekvenser sammen, der ikke ville naturligt eksistere under normale omstændigheder og miljømæssige forhold. Processen til fremstilling af rekombinant DNA fremstilles af en avanceret procedure i biologi og genetik kendt som genkloning. Rekombinant DNA sættes i en celle, som derefter producerer et helt nyt protein, og bruges til at syntetisere stoffer, antistoffer eller specifikke proteiner til forskning alene.

Introduktion

DNA fra en donororganisme eller biologisk kilde ekstraheres først fra celler og udsættes derefter for en skæreproces, der er kendt som enzymatisk restriktion. Dette genererer fragmenter af DNA, som indeholder genet eller gener af interesse. Disse fragmenter kan derefter være "klonet" (dvs. indsat) eller fast på fragmenter fra recipientorganismen. De indsættes derefter i større DNA-molekyler ("plasmider"), som placeres i en bakterie og får lov til at formere sig. Det rekombinante DNA udvindes og verificeres derefter.

DNA-isolering

DNA skal først ekstraheres og oprenses fra andre cellulære molekyler, såsom ribonukleinsyrer (RNA'er), proteiner og strukturer som celle membraner. Til kloningsformål opnås DNA fra kernen og er kendt som "genomisk DNA". En fælles metode til DNA-ekstraktion er ved ultracentrifugering af cellekomponenter i en densitetsgradient lavet med ethidiumbromid i cæsiumchlorid. Alternativt kan en række alkaliske og saltbuffervaske også bruges til at genvinde DNA'et. Når dette er udfældet og renset for alle andre uønskede forureninger, kan DNA'et skæres i fragmenter.

Restriktionsenzymfordøjelse af DNA

Restriktionsenzymer er enzymer, der skærer meget specifikke DNA-sekvenser; de er vant til at skabe unikke DNA-fragmenter. Denne proces sikrer, at der ikke genereres unøjagtige, ukorrekte eller uønskede sekvenser og bliver tilfældigt inkorporeret i det endelige rekombinante DNA, som kan resultere i både forsøgsfald og celledød. For at generere de ønskede DNA-fragmenter anvendes en specifik enkelt (eller kombination af) enzym (er) til at skære eller fordøje DNA'et. Fragmenterne renses derefter ved gelelektroforese, som adskiller dem fra det uønskede DNA. En rudermetode involverer simpelthen mekanisk klippe, som opskrækker de længere DNA-segmenter i mindre, som kan bruges til kloning.

DNA-ligning

Ligation er processen med at stikke sammen eller tilslutte donoren og modtager (eller vektor) DNA-fragmenter til dannelse af et rekombinant DNA-molekyle. Ideelt set ville restriktionsenzymerne, der blev valgt til at skabe fragmenterne, have været meget omhyggeligt gennemtænkt og designet således, at de tillader, at disse bits bliver sat sammen som et puslespil. For at gøre dette foretrækkes restriktionsenzymer, der frembringer forenelige "klæbrige ender", således at alle kompatible fragmenter naturligt kommer til at forbinde med hinanden; ellers kan DNA-ligase-enzymet bruges til at slutte sig til DNA-segmenterne med phosphodiesterbindinger.

Rekombinant DNA-replikation

Processen med transformation eller varmeskok anvendes til at sætte det rekombinante DNA-molekyle i en værtsbakteriecelle, som derefter kan danne mange kopier af det syntetiske DNA. Disse bakterier dyrkes på agarplader, dyrkes op i specielle bakteriebuljer og lyseres derefter for at frigive det rekombinante DNA. Endelig kan DNA'et verificeres ved DNA-sekventering, funktionelle forsøg og restriktionsenzymfordøjelse.