Et cellulært gennembrud:Højtydende CRISPR uden virale vektorer

En ny variation af CRISPR-Cas9-genredigeringssystemet gør det lettere at omkonstruere enorme mængder celler til terapeutiske anvendelser. Fremgangsmåden, der er udviklet ved Gladstone Institutes og UC San Francisco (UCSF), lader forskere introducere særligt lange DNA-sekvenser til præcise placeringer i cellers genomer med bemærkelsesværdig høj effektivitet uden de virale leveringssystemer, der traditionelt er blevet brugt til at transportere DNA ind i celler.

"Et af vores mål i mange år har været at sætte lange DNA-instruktioner ind i et målrettet sted i genomet på en måde, der ikke afhænger af virale vektorer," siger Alex Marson, MD, Ph.D., direktør for Gladstone. -UCSF Institute of Genomic Immunology og seniorforfatter af det nye studie. "Dette er et stort skridt mod den næste generation af sikre og effektive celleterapier."

I det nye papir offentliggjort i tidsskriftet Nature Biotechnology , beskriver Marson og hans kolleger ikke kun teknologien, men viser, hvordan den kan bruges til at generere CAR-T-celler med potentiale til at bekæmpe myelomatose, en blodkræft, samt til at omskrive gensekvenser, hvor mutationer kan føre til sjældent arvelig immunforsvar. sygdomme.

"Vi viste, at vi kan konstruere mere end en milliard celler i en enkelt kørsel, hvilket er langt over det antal celler, vi har brug for til at behandle en individuel patient," siger førsteforfatter Brian Shy, MD, Ph.D., en klinisk stipendiat i Marsons laboratorium.

Fra dobbelt- til enkeltstrenget DNA

CRISPR-Cas9, et system, der redigerer gener inde i levende celler, er blevet brugt som et grundlæggende forskningsværktøj i det sidste årti. Mange klinikere er i stigende grad begejstrede for potentialet ved CRISPR-Cas9 til at generere levende celleterapier.

Med genredigering kan man blandt andet slukke, slette eller erstatte et muteret, sygdomsfremkaldende gen eller booste en immuncelles kræftbekæmpende aktivitet. Mens de første terapeutiske applikationer af CRISPR-Cas9 for nylig er gået ind i kliniske forsøg, har teknologien stadig været begrænset af udfordringen med sikker fremstilling af store mængder af korrekt redigerede celler.

Traditionelt har forskere været afhængige af virale vektorer - skallerne af vira uden deres sygdomsfremkaldende komponenter - til at bære DNA'et (kaldet DNA-skabelonen), der bruges til genterapi, ind i cellerne. Fremstilling af bulkmængder af virale vektorer af klinisk kvalitet har imidlertid været en stor flaskehals i at få celleterapi til patienter. Derudover kan forskere ikke nemt kontrollere, hvor traditionelle virale vektorer indsætter gener i genomet.

"At bruge virale vektorer er dyrt og ressourcekrævende," siger Shy. "En stor fordel ved en ikke-viral tilgang til genteknologi er, at vi ikke er så begrænset af omkostninger, fremstillingskompleksitet og forsyningskædeudfordringer."

I 2015 viste Marsons gruppe – i samarbejde med laboratoriet af CRISPR-pioneren Jennifer Doudna, Ph.D. – for første gang, at de kunne indsætte korte DNA-skabeloner i immunceller uden virale vektorer ved hjælp af et elektrisk felt, der gør cellernes ydre membraner mere permeable . I 2018 udviklede de en metode til at klippe og indsætte længere DNA-sekvenser i immunceller med CRISPR og publicerede den i Nature .

Så i 2019 opdagede forskerne, at ved også at bruge en modificeret version af DNA-skabelonerne, der kan binde til Cas9-enzymet - det samme protein, der fungerer som molekylær saks under CRISPR-genredigering - kunne de levere de nye sekvenser til det målrettede genom websted mere effektivt. Dette arbejde blev offentliggjort i Nature Biotechnology .

Der var imidlertid behov for mere arbejde for at forbedre udbyttet af veludviklede immunceller og for at gøre processen kompatibel med fremstillingen af ​​fremtidige celleterapier. Disse mål motiverede holdets nuværende undersøgelse.

DNA kan eksistere i enkelt- eller dobbeltstrenge (som modstående stykker velcro), og Cas9 hæfter til dobbeltstrenget DNA. Forskerne opdagede hurtigt, at høje niveauer af dobbeltstrenget DNA-skabelon kan være toksisk for celler, så metoden kunne kun bruges med små mængder skabelon-DNA, hvilket fører til en lav effektivitet.

Holdet vidste, at enkeltstrenget DNA var mindre giftigt for celler, selv ved relativt høje koncentrationer. Så i det nye papir beskriver de en metode til at binde det modificerede Cas9-enzym til et enkeltstrenget template-DNA ved blot at tilføje et lille overhæng af dobbeltstrenget DNA i enderne.

"Dette giver os en afbalanceret tilgang af begge verdener," siger Marson.

Enkeltstrenget template-DNA kunne mere end fordoble effektiviteten af ​​genredigering sammenlignet med den ældre, dobbeltstrengede tilgang. Og de dobbeltstrengede ender af molekylerne lader forskere bruge Cas9 til at forbedre leveringen af ​​ikke-virale vektorer ind i celler.

"Denne teknologi har potentialet til at gøre nye celle- og genterapier hurtigere, bedre og billigere," siger Jonathan Esensten, MD, Ph.D., en forfatter til det nye arbejde, som er assisterende professor i laboratoriemedicin ved UCSF og en affiliate investigator hos Gladstone.

En vej til klinikken

I undersøgelsen brugte forskere den nye DNA-skabelon til at generere mere end en milliard CAR-T-celler, der retter sig mod myelomatose. CAR-T-celler er immun-T-celler, der er genetisk modificeret til effektivt at bekæmpe specifikke celler eller kræftformer. Med de nye enkeltstrengede, Cas9-rettede skabeloner fik cirka halvdelen af ​​alle T-celler det nye gen og blev som et resultat omdannet til CAR-T-celler.

"Vi vidste, at målretning af DNA-skabelonerne til et specifikt sted i genomet, kaldet TRAC-stedet, ville forbedre antitumorstyrken af ​​CAR-T-celler," siger Justin Eyquem, Ph.D., en medforfatter til nyt papir, assisterende professor i medicin i afdelingen for hæmatologi og onkologi ved UCSF og affiliate investigator på Gladstone. "Denne nye ikke-virale tilgang gør det muligt for os at opnå denne målretning meget mere effektivt, hvilket vil fremskynde udviklingen af ​​den næste generation af CAR-T-celleterapier."

Derudover viste forskerne, at deres tilgang for første gang i deres helhed kunne erstatte to gener forbundet med sjældne genetiske immunsygdomme, IL2RA- og CTLA4-generne.

Tidligere havde videnskabsmænd vist, at de kunne erstatte små dele af IL2RA-genet, hvor bestemte patienter har mutationer. Nu beviste Marsons team, at de kan erstatte hele IL2RA- og CTLA4-generne på én gang - en "one size fits all"-tilgang, der kunne behandle mange patienter med forskellige mutationer i disse gener, i stedet for at skulle generere personlige skabeloner for hver patients mutation. Næsten 90 procent af de celler, der blev behandlet med denne genteknologiske tilgang, fik de sunde versioner af generne.

Forskerne søger nu godkendelse til at fremme kliniske forsøg med ikke-viral CRISPR-teknologi i både CAR-T-celleterapi og behandling af IL2RA-mangel. + Udforsk yderligere

Undersøgelse tilskynder til en forsigtig tilgang til CRISPR-terapi