Glødende tags afslører aktivitet på splitsekund af patogene kredsløb

Syntetiske biologer ved Rice University har udviklet den første teknologi til at observere realtidsaktiviteten af ​​nogle af de mest almindelige signalbehandlingskredsløb i bakterier, herunder dødelige patogener, der bruger kredsløbene til at øge deres virulens samt til at udvikle antibiotikaresistens.

To-komponent systemer er sensoriske kredsløb, som bakterier bruger til at reagere på deres omgivelser og overleve. Bakterier bruger kredsløbene, som også er kendt som signaltransduktionsveje, til at fornemme et "uovertruffent udvalg af stimuli" fra lys og metalioner til pH og endda beskeder fra deres venner og naboer, sagde Rice bioingeniørprofessor Jeffrey Tabor.

Tabor og postdoc-forsker Ryan Butchers nye optiske værktøj til at observere phosphoryleringsreaktioner i realtid i to-komponentsystemer er beskrevet i en undersøgelse offentliggjort i denne uge i Proceedings of the National Academy of Sciences .

"Bakterier bruger to-komponent-systemer til at aktivere virulens og antibiotikaresistens, kolonisere menneske- og planteværter, danne biofilm og dårligt medicinsk udstyr," sagde Tabor, professor i både bioteknik og biovidenskab.

Tabors laboratorium har studeret to-komponent systemer i årevis. I 2019 afslørede hans team et biohacking-værktøjssæt, som syntetiske biologer kunne bruge til at blande og matche titusindvis af sensoriske input og genetiske output fra kredsløbene.

En af de vigtigste anvendelser af dette værktøjssæt var at låse op for det dobbelte mysterium med to-komponent systemer. Som deres navn antyder, har kredsløbene to funktioner:sansning af en stimulus uden for cellen og ændring af cellens adfærd som reaktion på denne stimulus.

Den første komponent, kendt som en sensorkinase, rager typisk ud gennem cellens ydervæg og kan kun aktiveres af et specifikt kemisk signal. Når den først er udløst, sætter den i gang en biokemisk kaskade, en kædereaktion inde i cellen, der ender med, at cellen ændrer sin adfærd som reaktion på stimuli.

Det første trin i kaskaden er en proces kaldet phosphorylering, som i sidste ende resulterer i aktivering af den anden komponent i systemet, responsregulatoren.

Selvom fosforyleringsreaktioner er nøglen i de titusindvis af to-komponent-systemer, der anvendes i bakterier, har det været meget vanskeligt at observere dem direkte i levende bakterier. Det skyldes til dels, at responsregulatorer typisk skal slutte sig sammen for at danne par for at fortsætte den biologiske kaskade, der fører til stimulusrespons.

"Eksperimentel analyse af phosphorylering kræver ofte oprensning af proteiner fra bakterier og analyse ved hjælp af besværlige in vitro-metoder som gelelektroforese," sagde Butcher.

Butcher skabte en meget enklere metode, der bruger fluorescerende proteinmærker og polariseret fluorescerende lys. Han konstruerede stammer af E. coli til at producere mNeonGreen fluorescerende proteinprober, der depolariserer lys fra en excitationslaser, men kun hvis de interagerer som par. I en række tests viste Butcher og Tabor, at deres metode kunne bruges til at overvåge størrelsen og hastigheden af ​​aktivering af responsregulatoren under en række forskellige miljøforhold.

Metoden kaldes "homotypisk fluorescensresonansenergioverførsel" eller forkortet homo-FRET. Tabor sagde, at forskere kan bruge det til at følge aktiveringen af ​​to-komponent systemer med meget højere tidsopløsning end tidligere muligt.

I undersøgelsen demonstrerede han og Butcher nytten af ​​homo-FRET ved at observere et nitrataktiveret to-komponent system, der vides at spille en rolle i gastrointestinal kolonisering af E. coli, Salmonella og andre patogener.

"Mikrobiologer har i nogen tid vidst, at dette genetiske kredsløb bruges af en række patogener, men vi forstår stadig ikke helt, hvordan det virker," sagde Tabor.

Ved hjælp af deres metode opdagede Tabor og Butcher en tidligere urapporteret aktivitetspuls i kredsløbet som reaktion på tilsætning af nitrat. Pulsen ser ud til at opstå på grund af hurtig aktivering af to-komponent systemet efterfulgt af forbrug af nitrat af bakterierne og tilsvarende deaktivering.

"Det er et vindue til, hvordan dette kredsløb fungerer, og det er den slags ting, der ville have været meget sværere at fastlægge ved hjælp af tidligere metoder," sagde Tabor. "Med homo-FRET kan vi se kredsløbet reagere på skiftende nitratniveauer, mens det sker."

"Vi tror, ​​at homo-FRET kan bruges til at konstruere biosensorer, der reagerer 10 gange hurtigere end nuværende alternativer, og at vi og andre vil være i stand til at bruge det til at gøre nye opdagelser i en række andre bakterielle veje," sagde han. + Udforsk yderligere

Syntetiske biologer hacker bakteriesensorer