Læser RNA-modifikationer mere præcist i en enhed i lommestørrelse

To nye tilgange kunne hjælpe forskere med at bruge eksisterende sekventeringsteknologi til bedre at skelne RNA-ændringer, der påvirker, hvordan genetisk kode læses.

Forskere fra Kyoto University kommer tættere på at finde måder at identificere ændringer i RNA-sekvenser, der påvirker proteindannelsen og kan forårsage sygdomme. Deres tilgang, offentliggjort i tidsskriftet Genomics , bruger sandsynlighedsalgoritmer sammen med en allerede tilgængelig sekventeringsenhed i lommestørrelse.

"Modifikationer, der findes i alle typer af biologisk RNA, påvirker genreguleringen, som i sidste ende bestemmer, hvordan forskellige celler fungerer i vores krop," forklarer Ganesh Pandian Namasivayam fra Kyoto University's Institute for Integrated Cell-Material Science (WPI-iCeMS). "Anormaliteter i disse modifikationer kan føre til alvorlige sygdomme, såsom diabetes, neuroudviklingsforstyrrelser og kræft. At vide, hvordan og hvor disse RNA-modifikationer er, er af største betydning fra et klinisk synspunkt," tilføjer Soundhar Ramaswamy, undersøgelsens første forfatter.

Der er allerede måder at identificere RNA-modifikationer på, men de er utilstrækkelige. Biofysiske tilgange såsom kromatografi og massespektrometri kan kun behandle små mængder RNA ad gangen. High-throughput sekventeringsmetoder, som kan behandle store mængder RNA, involverer besværlig prøveforberedelse, kan ikke samtidig kortlægge flere modifikationer og er fejltilbøjelige.

Namasivayam, Hiroshi Sugiyama og kolleger ved Kyoto University testede og fandt to tilgange, der relativt succesfuldt kan skelne mellem en velkendt og rigelig RNA-modifikation, der involverer udskiftning af nukleotidbasen uracil med en anden kaldet pseudouridin.

I lighed med DNA er RNA dannet af en streng af forskellige kombinationer af fire forskellige nukleotidbaser:uracil, cytosin, adenin og guanin. Hvordan disse baser er arrangeret bestemmer koden, der signalerer, hvilket protein der er beregnet til at blive lavet. Når pseudouridin erstatter uracil i RNA-rygraden, kan det føre til øget proteinproduktion eller til at ændre koden fra en kode, der signalerer afbrydelse af informationsoversættelse til en, der signalerer aminosyredannelse.

Holdets tilgang involverer at bruge en allerede tilgængelig direkte RNA-sekventeringsplatform udviklet af Oxford Nanopore Technologies. I denne platform passerer RNA-strenge gennem bittesmå porer i en membran. Forstyrrelser er forårsaget af strømmen, der bevæger sig gennem membranen afhængigt af rækkefølgen af ​​de forskellige RNA-baser. Dette gør det muligt for videnskabsmænd at "læse" sekvensen. Men forskere, der bruger denne tilgang, har ofte svært ved at skelne forskellige typer modifikationer fra hinanden.

Shubham Mishra, en fælles førsteforfatter af denne undersøgelse, udviklede algoritmer til at identificere en høj sandsynlighed for eksistensen af ​​en pseudouridinsubstitution sammenlignet med muligheden for, at det var en anden slags baseændring.

En af deres strategier sammenligner korte RNA-kørsler af fem nukleotidbaser, hvor uracil, pseudouridin eller cytosin er omgivet på hver side af de samme baser. Aflæsningerne går derefter gennem algoritmer, der beregner sandsynligheden for, at den midterste base er en af ​​de tre. De brugte deres strategi, kaldet Indo-Compare (Indo-C), på konstruerede RNA-sekvenser og derefter på gær og humant RNA og fandt ud af, at den var god til at skelne pseudouridinsubstitutionerne fra de andre.

De var også i stand til at identificere pseudouridinsubstitutioner ved at blande en kemisk probe med RNA-prøver, som derefter selektivt binder til dem. Dette ændrede sekvensaflæsningerne på en måde, der identificerer ændringen.

"Vi tror på, at vores arbejde vil gøre nanopore-sekventeringsbaserede metoder mindre besværlige til at detektere RNA-modifikationer og mere i stand til at karakterisere virkningerne af disse modifikationer på udvikling og sygdom," siger Namasivayam.

Holdet sigter derefter på at optimere brugen af ​​begge tilgange sammen for mere præcist at identificere RNA- og DNA-modifikationer. Dette vil involvere fremstilling af nye kemiske sonder, der svarer til specifikke ændringer. De planlægger også at videreudvikle avancerede maskinlæringsalgoritmer, der komplementerer kemiske probe-baserede direkte RNA-sekventeringstilgange. + Udforsk yderligere

Sekventering af flere RNA-basemodifikationer samtidigt:En ny æra af RNA-biologi