Forskere belyser den rumlige struktur og molekylære mekanismer af prime editor, et nyt genredigeringsværktøj

Fælles forskning ledet af Yutaro Shuto, Ryoya Nakagawa og Osamu Nureki fra University of Tokyo bestemte den rumlige struktur af forskellige processer i et nyt genredigeringsværktøj kaldet "prime editor". Funktionel analyse baseret på disse strukturer afslørede også, hvordan en "prime editor" kunne opnå revers transkription, syntetisere DNA fra RNA, uden at "skære" begge strenge af den dobbelte helix.

Afklaring af disse molekylære mekanismer bidrager i høj grad til at designe genredigeringsværktøjer, der er nøjagtige nok til genterapibehandlinger. Resultaterne er publiceret i tidsskriftet Nature .

Nobelprisen i kemi 2020 blev tildelt Jennifer Doudna og Emmanuelle Charpentier for at udvikle en banebrydende, men alligevel enkel måde at redigere DNA, "blåprintet" af levende organismer. Mens deres opdagelse åbnede nye veje for forskning, begrænsede metodens nøjagtighed og sikkerhedsmæssige betænkeligheder ved at "skære" begge DNA-strenge dens anvendelse til genterapibehandlinger. Som sådan har der været forskning i gang for at udvikle værktøjer, der ikke har disse ulemper.

Det primære redigeringssystem er et sådant værktøj, et molekylekompleks bestående af to komponenter. En komponent er den primære editor, som kombinerer et SpCas9-protein, brugt i den første CRISPR-Cas-genredigeringsteknologi, og en revers transkriptase, et enzym, der transkriberer RNA til DNA.

Den anden komponent er det primære redigeringsguide-RNA (pegRNA), et modificeret guide-RNA, der identificerer målsekvensen i DNA'et og koder for den ønskede redigering. I dette kompleks fungerer den primære editor som en "tekstbehandler", der nøjagtigt erstatter genomisk information. Værktøjet er allerede med succes implementeret i levende celler fra organismer såsom planter, zebrafisk og mus. Men præcis hvordan dette molekylekompleks udfører hvert trin i redigeringsprocessen har ikke været klart, hovedsagelig på grund af mangel på information om dets rumlige struktur.

"Vi blev nysgerrige efter, hvordan den unaturlige kombination af proteiner Cas9 og revers transkriptase arbejder sammen," siger Shuto, den første forfatter af papiret.

Forskerholdet brugte kryogen elektronmikroskopi, en billeddannelsesteknik, der gør observationer mulige på en atomær skala. Metoden krævede, at prøverne var i glasagtig is for at beskytte dem mod potentiel skade fra elektronstrålerne, hvilket medførte nogle yderligere udfordringer.

"Vi fandt, at prime editor-komplekset var ustabilt under eksperimentelle forhold," forklarer Shuto. "Så det var meget udfordrende at optimere betingelserne for, at komplekset kunne forblive stabilt. I lang tid kunne vi kun bestemme strukturen af ​​Cas9."

Til sidst at overvinde udfordringerne lykkedes det forskerne at bestemme den tredimensionelle struktur af det primære editor-kompleks i flere tilstande under omvendt transkription på mål-DNA'et.

Strukturerne afslørede, at den omvendte transkriptase bandt til RNA-DNA-komplekset, der dannedes langs "delen" af Cas9-proteinet forbundet med DNA-spaltning, spaltningen af ​​en enkelt streng af dobbelthelixen. Mens den omvendte transkription blev udført, bibeholdt den omvendte transkriptase sin position i forhold til Cas9-proteinet. De strukturelle og biokemiske analyser indikerede også, at revers transkriptase kunne føre til yderligere, uønskede insertioner.

Disse resultater har åbnet nye veje for både grundforskning og anvendt forskning. Så Shuto opstiller de næste trin.

"Vores strukturbestemmelsesstrategi i denne undersøgelse kan også anvendes på prime-editorer sammensat af et andet Cas9-protein og revers transkriptase. Vi ønsker at bruge den nyligt opnåede strukturelle information til at føre til udviklingen af ​​forbedrede prime-editorer."

Flere oplysninger: Strukturelt grundlag for pegRNA-styret revers transkription af den primære editor, Nature (2024). DOI:10.1038/s41586-024-07497-8 , https://www.nature.com/articles/s41586-024-07497-8

Journaloplysninger: Natur

Leveret af University of Tokyo