DNA-kloning: Definition, proces, eksempler

Det er muligt at klone hele organismer som fåren Dolly, men DNA-kloning er anderledes. Den bruger molekylærbiologiteknikker til at fremstille identiske kopier af DNA-sekvenser eller enkeltgener.

Ved hjælp af genteknologiske metoder identificeres og isoleres segmenter af den DNA-genetiske kode. DNA-kloning kopierer derefter nukleinsyresekvenserne i segmenterne.

De resulterende identiske kopier kan bruges til yderligere forskning eller til bioteknologiske anvendelser. Ofte koder genet, der kopieres, for et protein, der kan udgøre en del af medicinske behandlinger. DNA-teknologi inklusive DNA-kloning understøtter forståelsen af, hvordan gener fungerer, og hvordan den genetiske kode for mennesker påvirker kroppens funktion.
DNA-kloning: Definition og procesoversigt

DNA-kloning er molekylærbiologisk proces at fremstille identiske kopier af DNA-segmenter placeret i kromosomerne, der indeholder den genetiske kode for avancerede organismer.

Processen genererer store mængder af mål-DNA-sekvenserne
. Målet med DNA-kloning er at fremstille mål-DNA-sekvenserne i sig selv eller at producere de proteiner, der er kodet i målsekvenserne.

De to metoder, der anvendes i DNA-kloning kaldes plasmidvektor
og polymerasekædereaktion (PCR)
. I plasmidvektorfremgangsmåden skæres DNA-strenge under anvendelse af restriktionsenzymer
til frembringelse af DNA-fragmenter, og de resulterende segmenter indsættes i kloningsvektorer kaldet plasmider til yderligere duplikering. Plasmiderne anbringes i bakterieceller, der derefter producerer DNA-kopier eller kodede proteiner.

I PCR-metoden markeres segmentet af DNA-strenge, der skal duplikeres, med enzymer kaldet primere
. Et polymeraseenzym fremstiller kopier af den markerede del af DNA-strengen. Denne metode bruger ikke restriktionsenzymer og kan producere klonet DNA fra små prøver. Nogle gange bruges de to DNA-teknologimetoder sammen for at inkorporere de bedste egenskaber ved hver i en samlet reaktion.
Plasmidvektormetoden

Metodens vektor henviser til det plasmid, der bruges til at holde mål-DNA-segmentet skal klones. Plasmider er små cirkulære strenge af ikke-kromosomalt DNA og findes i mange organismer, herunder bakterier og vira.

Bakterielle plasmider er den vektor, der bruges til at indsætte mål-DNA-segmentet i bakterieceller til yderligere duplikering.

Valg og isolering af mål-DNA: Inden DNA-kloningsprocessen kan begynde, skal DNA-sekvenserne identificeres, især begyndelsen og enderne af DNA-segmenterne.

Sådanne DNA-sekvenser kan findes ved anvendelse af eksisterende klonet DNA med kendte sekvenser eller ved undersøgelse af proteinet produceret af mål-DNA-sekvensen. Når sekvensen er kendt, kan de tilsvarende restriktionsenzymer bruges.

Skæring af mål-DNA med restriktionsenzymer: Restriktionsenzymer vælges for at se efter DNA-koden i begyndelsen og slutningen af målsekvenserne.

Når restriktionsenzymerne finder en speciel kodet sekvens af basepar, der kaldes restriktionssteder, binder de sig til DNAet på det sted og vikler sig rundt om DNA-molekylet, hvorved strengen adskilles. De afskårne DNA-segmenter, der indeholder målsekvensen, er nu tilgængelige til duplikering.

Valg af plasmidvektor og indsættelse af måldNA: Et egnet plasmid indeholder ideelt de samme DNA-kodende sekvenser som den DNA-streng, hvorfra mål-DNA'et var skære. Den cirkulære DNA-streng af plasmidet skæres med de samme restriktionsenzymer, som blev anvendt til at skære mål-DNA.

Et DNA-ligaseenzym
bruges til at fremme DNA-segmentbinding, og enderne af mål-DNA-segmentet hænger sammen med de afskårne ender af plasmid-DNA'et. Mål-DNA udgør nu en del af den cirkulære plasmid-DNA-streng.

Indsættelse af plasmidet i en bakteriecelle: Når først plasmidet indeholder den DNA-sekvens, der skal klones, kan den faktiske kloning finde sted ved hjælp af en proces kaldet bakterietransformation
. Plasmiderne indsættes i en bakteriecelle, såsom E. coli, og cellerne med de nye DNA-segmenter vil begynde at producere kopier og de tilsvarende proteiner.

Ved bakterietransformation inkuberes værtscellerne og plasmiderne sammen ved Cellerne absorberer nogle af plasmiderne og behandler dem som deres eget plasmid-DNA.

Høst af det klonede DNA og proteiner: De fleste plasmider, der bruges til DNA-kloning, har antibiotikaresistensgener, der er inkorporeret i deres DNA. Når bakteriecellerne absorberer de nye plasmider, bliver de resistente over for antibiotika.

Når kulturen behandles med antibiotika, overlever det kun de celler, der har absorberet de nye plasmider. Resultatet er en ren kultur af bakterieceller med klonet DNA. At DNA derefter kan høstes, eller det tilsvarende protein kan produceres.
PCR (Polymerase Chain Reaction) -metoden

PCR-metoden er enklere og kopierer eksisterende DNA på plads. Det kræver ikke skæring med restriktionsenzymer eller indsættelse af plasmid-DNA-sekvenser. Dette gør det især velegnet til kloning af DNA-prøver med et begrænset antal DNA-strenge. Mens metoden kan klone DNA, kan den ikke bruges til produktion af det tilsvarende protein.

Afvikling af DNA-strengene: DNA i kromosomer er tæt opviklet i en dobbelt spiralstruktur. Opvarmning af DNA til 96 grader celsius i en proces kaldet denaturering og får DNA-molekylet til at opspole og adskilles i to strenge. Denne adskillelse er påkrævet, fordi kun en enkelt streng DNA kan klones ad gangen.

Valg af primerne: Som med plasmidvektor-DNA-kloning, skal de DNA-sekvenser, der skal klones, identificeres med særlig vægt på begyndelser og ender af DNA-segmenterne. Primere er enzymer, der binder sig til specifikke DNA-kodesekvenser, og de skal vælges for at markere mål-DNA-segmenterne. De rigtige primere vil fastgøre til DNA-molekylsekvenserne for at markere begyndelsen og enderne af målsegmenterne.

Udglødning af reaktionen for at binde primerne: Afkøling af reaktionen til ca. 55 grader Celsius kaldes annealing
. Når reaktionen afkøles, aktiveres primerne og binder sig til DNA-strengen i hver ende af et mål-DNA-segment. Primerne fungerer kun som markører, og DNA-strengen behøver ikke at blive skåret.

Fremstilling af identiske kopier af mål-DNA-segmentet: I en proces kaldet udvidelse
, den varmefølsomme TAQ polymeraseenzym sættes til reaktionen. Reaktionsblandingen opvarmes derefter til 72 grader celsius ved aktivering af enzymet. Det aktive DNA-polymeraseenzym binder til primerne og kopierer DNA-sekvensen imellem dem. Den indledende DNA-sekventerings- og kloningsproces er afsluttet.

Forøgelse af udbyttet af klonet DNA: Den indledende annealings- og udvidelsesproces skaber relativt få kopier af de tilgængelige DNA-strengssegmenter. For at øge udbyttet gennem yderligere DNA-replikation afkøles reaktionen igen for at aktivere primerne igen og lade dem binde til andre DNA-strenge.

Derefter aktiverer reaktionsreaktionen polymerase-enzymet igen og flere kopier produceres. Denne cyklus kan gentages 25 til 30 gange.
Brug af plasmidvektor- og PCR-DNA-kloningsmetoder sammen.

Plasmidvektormetoden er afhængig af en rigelig initial tilførsel af DNA til at skære og indsætte i plasmider. For lidt originalt DNA resulterer i færre plasmider og en langsom start på klonet DNA-produktion.

PCR-metoden kan producere en stor mængde DNA fra få originale DNA-strenge, men fordi DNA'et ikke er implanteret i en bakteriecelle , er proteinproduktion ikke mulig.

For at fremstille det protein, der er kodet i DNA-fragmenterne, der skal klones fra en lille initial DNA-prøve, kan de to metoder anvendes sammen, og de kan komplementere hinanden. Først bruges PCR-metoden til at klone DNA fra en lille prøve og producere mange kopier.

Derefter anvendes PCR-produkterne med plasmidvektormetoden til at implantere det producerede DNA i bakterieceller, der vil producere det ønskede protein.
Eksempler på DNA-kloning til bioteknologi

Molekylærbiologi bruger genkloning og DNA-replikation til medicinske og kommercielle formål. Bakterierne med klonede DNA-sekvenser bruges til at producere medicin og erstatte stoffer, som mennesker med genetiske lidelser ikke selv kan producere.

Typiske anvendelser inkluderer: