Hvor specifikt protein kan detekteres i western blot?

Western blotting er en kraftfuld teknik, der bruges til at detektere specifikke proteiner i en prøve. Det involverer at adskille proteiner baseret på deres størrelse og derefter bruge antistoffer til specifikt at målrette og visualisere proteinet af interesse. Her er en trin-for-trin forklaring på, hvordan et specifikt protein kan påvises i et western blot:

1. Proteinekstraktion og -forberedelse:

- Det første trin er at udtrække proteiner fra prøven af ​​interesse. Dette kan gøres ved hjælp af forskellige metoder, såsom cellelyse eller vævshomogenisering, efterfulgt af centrifugering for at fjerne cellerester.

- De ekstraherede proteiner kvantificeres derefter, typisk ved hjælp af et Bradford-assay eller lignende metoder, for at sikre ens proteinbelastning i efterfølgende trin.

2. Proteinseparation:

- Proteinprøven blandes med en ladningsbuffer, der indeholder et reduktionsmiddel (f.eks. beta-mercaptoethanol eller DTT) og et sporingsfarvestof (f.eks. bromphenolblåt).

- Proteinblandingen fyldes på en polyacrylamidgel til elektroforese. Gelen udsættes for en elektrisk strøm, hvilket får proteinerne til at adskilles baseret på deres størrelse. Mindre proteiner migrerer hurtigere gennem gelen, mens større proteiner bevæger sig langsommere.

3. Proteinoverførsel:

- Efter elektroforese overføres de separerede proteiner fra gelen til en nitrocellulosemembran eller polyvinylidendifluorid (PVDF) membran. Denne proces, kendt som proteinblotting eller elektroblotting, involverer at placere gelen og membranen i en overførselsbuffer og påføre en elektrisk strøm.

- Som følge heraf overføres proteinerne fra gelen til membranen, hvorved der skabes en replika af de adskilte proteiner.

4. Membranblokering:

- For at reducere uspecifik binding af antistoffer blokeres nitrocellulose- eller PVDF-membranen med en opløsning indeholdende et protein såsom bovint serumalbumin (BSA) eller fedtfri tørmælk.

- Dette blokeringstrin hjælper med at minimere baggrundssignaler og forbedrer specificiteten af ​​antistofbinding under de efterfølgende trin.

5. Primær antistofinkubation:

- Membranen inkuberes med et primært antistof, der specifikt genkender og binder sig til proteinet af interesse. Primære antistoffer genereres typisk mod målproteinet eller en specifik epitop i proteinet.

- Disse antistoffer fortyndes i en passende buffer og inkuberes med membranen, så de kan binde sig til deres målproteiner.

6. Vask:

- Efter den primære antistofinkubation vaskes membranen grundigt for at fjerne ubundne antistoffer og reducere baggrundssignaler. Dette vasketrin er afgørende for at sikre specifik påvisning af målproteinet.

7. Sekundær antistofinkubation (konjugeret med et reporterenzym):

- Et sekundært antistof, konjugeret til et enzym såsom peberrodsperoxidase (HRP) eller alkalisk phosphatase (ALP), bruges til at påvise de primære antistof-antigen-komplekser på membranen.

- Sekundære antistoffer er artsspecifikke, hvilket betyder, at de genkender og binder til de primære antistoffer, der produceres i en bestemt art (f.eks. mus eller kanin).

- Det enzym-konjugerede sekundære antistof binder til det primære antistof, hvilket skaber et kompleks, der muliggør signalamplifikation og visualisering.

8. Vask:

- Et andet vasketrin udføres for at fjerne ubundne sekundære antistoffer og reducere baggrundssignaler.

9. Kemiluminescensdetektion:

- For HRP-konjugerede sekundære antistoffer tilsættes et kemiluminescerende substrat til membranen. Når underlaget reagerer med HRP, udsender det lys.

- Specialiserede kemiluminescensdetektionssystemer eller røntgenfilm bruges til at fange og visualisere de udsendte lyssignaler. Lysets intensitet svarer til mængden af ​​målproteinet, der er til stede i prøven.

10. Dataanalyse og fortolkning:

- Den fremkaldte røntgenfilm eller digitale kemiluminescensbilleder analyseres for at identificere bånd eller pletter svarende til målproteinet.

- Størrelsen og intensiteten af ​​disse bånd kan give information om molekylvægt, overflod og post-translationelle modifikationer af det detekterede protein.

Ved at følge disse trin giver western blotting mulighed for specifik påvisning og analyse af et protein af interesse i en kompleks blanding af proteiner. Det er meget udbredt inden for forskellige områder af biologisk forskning, herunder molekylærbiologi, immunologi og klinisk diagnostik.