Hvad skal videnskabsmand gøre for at finde gen, der producerer protein, efter at han lokaliserede alt mRNA produceret af lever og cDNA, hvis ønsker kunstneringsprodukter er i frøer?

Her er en sammenbrud af de trin, som en videnskabsmand ville tage for at finde genet, der er ansvarlig for et protein produceret af leveren, ved hjælp af mRNA og cDNA og derefter producere det i frøceller:

1. Isolering af mRNA fra leveren

* vævsindsamling: Videnskabsmanden ville få levervæv fra et dyr (ideelt set en art, der ligner frøen, men det kan være en anden art om nødvendigt).

* RNA -ekstraktion: De ville bruge standardteknikker til at udtrække total RNA fra levervævet. Dette RNA vil omfatte både mRNA og andre RNA -typer.

* mRNA -isolering: De vil derefter rense mRNA ved hjælp af en teknik kaldet Poly-A-selektion. Denne proces udnytter det faktum, at de fleste mRNA'er har en poly-A-hale ved 3 'enden.

2. Oprettelse af et cDNA -bibliotek

* omvendt transkription: Ved hjælp af omvendt transkriptase ville videnskabsmanden omdanne det isolerede mRNA til komplementært DNA (cDNA). Dette cDNA repræsenterer de kodende sekvenser af generne udtrykt i leveren.

* kloning: CDNA -molekylerne ville blive klonet i en vektor (f.eks. Et plasmid eller en bakteriofag) for at skabe et cDNA -bibliotek. Dette bibliotek opbevarer i det væsentlige alle de gener, der er udtrykt i leveren.

3. Identificering af genet af interesse

* mRNA-sekventering (RNA-seq): Videnskabsmanden kunne sekvensere alle mRNA'er i leveren. Ved at sammenligne sekvenserne med en database med kendte gener kan de identificere mRNA, der koder for proteinet af interesse.

* differentiel display eller mikroarray -analyse: Disse teknikker giver videnskabsmanden mulighed for at sammenligne genekspressionsmønstrene i leveren (hvor proteinet produceres) med andre væv. Dette kan hjælpe med at præcisere gener, der specifikt udtrykt i leveren.

* Antistofscreening: Hvis proteinet allerede er kendt, kunne videnskabsmanden bruge antistoffer, der specifikt binder til proteinet for at screene cDNA -biblioteket. Dette vil direkte identificere cDNA -klonen, der koder for proteinet.

4. Ekspression i frøceller

* genkloning: Genet, der koder for proteinet af interesse, nu identificeret i cDNA -biblioteket, skal isoleres og klones i en vektor, der kan bruges til at levere det til frøceller.

* Vector Choice: Vektoren skal indeholde de nødvendige regulatoriske elementer (promotor, polyadenyleringssignal) for at sikre, at genet transkriberes og oversættes i frøceller.

* Transfektion/injektion: Vektoren, der indeholder genet, introduceres i frøceller. Der er forskellige metoder til dette:

* transfektion: Brug af kemikalier eller andre metoder til at levere vektoren til dyrkede frøceller.

* injektion: Injicerer direkte vektoren i frøembryoer eller udvikler væv.

* verifikation: Videnskabsmanden bliver nødt til at verificere, at proteinet produceres i frøcellerne:

* Immunofluorescens: Under anvendelse af fluorescerende antistoffer til at detektere proteinet inde i cellerne.

* Western blot: Under anvendelse af antistoffer til at påvise proteinet i cellelysater.

* Funktionelle assays: Testning af, om proteinet har den forventede biologiske aktivitet i frøcellerne.

Nøgleovervejelser:

* artsforskelle: Mens genet kan findes i en anden art, kan der være forskelle i, hvordan det reguleres eller udtrykt i frøer. Dette kræver muligvis justeringer af vektoren eller andre eksperimentelle forhold.

* genregulering: Videnskabsmanden bliver nødt til at overveje de regulerende elementer, der kontrollerer genets udtryk i frøen. Disse kan afvige fra den originale art.

* etiske bekymringer: Forskning, der involverer dyremodeller, kræver nøje overvejelse af etiske implikationer.

Fortæl mig, hvis du gerne vil have mig til at udvide på et bestemt trin eller aspekt!