Første atomstruktur af en intakt virus, der er dechiffreret med en røntgenlaser

Et internationalt team af forskere har for første gang brugt en røntgenfri elektron-laser til at opklare strukturen af ​​en intakt viruspartikel på atomniveau. Den anvendte metode reducerer den nødvendige mængde virusmateriale dramatisk, samtidig med at undersøgelserne også kan udføres flere gange hurtigere end tidligere. Dette åbner helt nye forskningsmuligheder, som forskerholdet ledet af DESY -videnskabsmanden Alke Meents rapporterer i tidsskriftet Naturmetoder .

På området kendt som strukturbiologi, forskere undersøger den tredimensionelle struktur af biologiske molekyler for at finde ud af, hvordan de fungerer. Denne viden styrker vores forståelse af de grundlæggende biologiske processer, der finder sted inde i organismer, såsom den måde, hvorpå stoffer transporteres ind og ud af en celle, og kan også bruges til at udvikle nye lægemidler.

"At kende den tredimensionelle struktur af et molekyle som et protein giver stor indsigt i dets biologiske adfærd, "forklarer medforfatter David Stuart, Direktør for biovidenskab ved synkrotronfaciliteten Diamond Light Source i Storbritannien og professor ved University of Oxford. "Et eksempel er, hvordan forståelse af strukturen af ​​et protein, som en virus bruger til at 'kroge' på en celle, kan betyde, at vi er i stand til at designe et forsvar for cellen for at gøre virussen ude af stand til at angribe den."

Røntgenkrystallografi er langt det mest produktive værktøj, der bruges af strukturbiologer og har allerede afsløret strukturer for tusinder af biologiske molekyler. Der dyrkes små krystaller af proteinet af interesse, og derefter belyst ved hjælp af højenergirøntgenstråler. Krystallerne diffrakterer røntgenstrålerne på karakteristiske måder, så de resulterende diffraktionsmønstre kan bruges til at udlede krystalets rumlige struktur - og dermed dens komponenter - på atomskalaen. Imidlertid, proteinkrystaller er ikke nær så stabile og robuste som saltkrystaller, for eksempel. De er svære at vokse, forbliver ofte små, og bliver let beskadiget af røntgenstrålerne.

"Røntgenlasere har åbnet en ny vej til proteinkrystallografi, fordi deres ekstremt intense pulser kan bruges til at analysere selv ekstremt små krystaller, der ikke ville producere et tilstrækkeligt lyst diffraktionsbillede ved hjælp af andre røntgenkilder, "tilføjer medforfatter Armin Wagner fra Diamond Light Source. Dog, hver af disse mikrokrystaller kan kun producere et enkelt diffraktionsbillede, før det fordamper som følge af røntgenpulsen. For at udføre strukturanalysen, selvom, hundredvis eller endda tusinder af diffraktionsbilleder er nødvendige. I sådanne forsøg, forskere injicerer derfor en fin flydende stråle af proteinkrystaller gennem en pulserende røntgenlaser, som frigiver en hurtig sekvens af ekstremt korte bursts. Hver gang en røntgenpuls rammer en mikrokrystal, et diffraktionsbillede produceres og optages.

Denne metode er meget vellykket og er allerede blevet brugt til at bestemme strukturen af ​​mere end 80 biomolekyler. Imidlertid, det meste af prøvematerialet er spildt. "Slaghastigheden er typisk mindre end to procent af pulserne, så de fleste af de dyrebare mikrokrystaller ender ubrugt i opsamlingsbeholderen, "siger Meents, der er baseret på Center for Free-Electron Laser Science (CFEL) i Hamborg, et samarbejde fra DESY, universitetet i Hamburg og det tyske Max Planck Society. Standardmetoden kræver derfor typisk flere timers stråletid og betydelige mængder prøvestof.

For mere effektivt at bruge den begrænsede stråletid og det dyrebare prøvemateriale, teamet udviklede en ny metode. Forskerne bruger en mikromønstret chip, der indeholder tusindvis af små porer til at holde proteinkrystallerne. Røntgenlaseren scanner derefter chippen linje for linje, og ideelt set muliggør dette, at der kan optages et diffraktionsbillede for hver puls i laseren.

Forskergruppen testede sin metode på to forskellige virusprøver ved hjælp af LCLS røntgenlaseren på SLAC National Accelerator Laboratory i USA, som producerer 120 impulser i sekundet. De læssede deres prøveholder med en lille mængde mikrokrystaller af kvæg enterovirus 2 (BEV2), en virus, der kan forårsage aborter, dødfødsler, og infertilitet hos kvæg, og som er meget vanskelig at krystallisere.

I dette eksperiment, forskerne opnåede en hitrate - hvor røntgenlaseren med succes målrettede krystallen - på op til ni procent. Inden for kun 14 minutter havde de indsamlet nok data til at bestemme den korrekte struktur af virussen - som allerede var kendt fra forsøg med andre røntgenlyskilder - ned til en skala på 0,23 nanometer (milliontedele af en millimeter).

"Så vidt vi ved, dette er første gang atomstrukturen af ​​en intakt viruspartikel er blevet bestemt ved hjælp af en røntgenlaser, "Meents påpeger." Hvorimod tidligere metoder ved andre røntgenlyskilder krævede krystaller med et samlet volumen på 3,5 nanoliter, det lykkedes os at bruge krystaller, der var mere end ti gange mindre, med et samlet volumen på kun 0,23 nanoliter. "

Dette forsøg blev udført ved stuetemperatur. Mens afkøling af proteinkrystallerne i nogen grad ville beskytte dem mod strålingsskader, dette er generelt ikke muligt, når man arbejder med ekstremt følsomme viruskrystaller. Krystaller af isolerede virusproteiner kan, imidlertid, være frosset, og i en anden test, forskerne studerede det virale protein polyhedrin, der udgør et viralt okklusionslegeme for op til flere tusinde viruspartikler af visse arter. Viruspartiklerne bruger disse beholdere til at beskytte sig mod miljøpåvirkninger og er derfor i stand til at forblive intakte i meget længere tid.

Til den anden test, videnskabsmanden fyldte deres chip med polyhedrin-krystaller og undersøgte dem ved hjælp af røntgenlaseren, mens chippen blev holdt ved temperaturer under minus 180 grader Celsius. Her, forskerne opnåede en hitrate på op til 90 procent. På bare ti minutter havde de optaget mere end nok diffraktionsbilleder til at bestemme proteinstrukturen inden for 0,24 nanometer. "For strukturen af ​​polyhedrin, vi skulle kun scanne en enkelt chip, der var fyldt med fire mikrogram proteinkrystaller; det er størrelsesordener mindre end det beløb, der normalt ville være nødvendigt, "forklarer Meents.

"Vores tilgang reducerer ikke kun dataindsamlingstiden og mængden af ​​den nødvendige prøve, det åbner også mulighed for at analysere hele vira ved hjælp af røntgenlasere, "Meents opsummerer. Forskerne vil nu øge kapaciteten af ​​deres chip med en faktor ti, fra 22, 500 til omkring 200, 000 mikroporer, og yderligere øge scannehastigheden til op til tusind prøver pr. sekund. Dette ville bedre udnytte potentialet i den nye røntgenfri-elektronlaser European XFEL, som lige er i drift i Hamborg -regionen, og som vil kunne producere op til 27, 000 pulser i sekundet. Desuden, den næste generation af chips vil kun afsløre de mikroporer, der i øjeblikket analyseres, at forhindre de resterende krystaller i at blive beskadiget af spredt stråling fra røntgenlaseren.

Forskere fra University of Oxford, universitetet i det østlige Finland, schweiziske Paul Scherrer Institute, Lawrence Berkeley National Laboratory i USA og SLAC var også involveret i forskningen. Diamantforskere har samarbejdet med teamet på DESY, med meget af udviklingen og afprøvningen af ​​den mikromønstrede chip udført på Diamond's I02 og I24 beamlines.