Nucleus-specifik røntgenfarvning til 3-D virtuel histologi

Histologi bruges til at identificere strukturelle detaljer i væv i mikroskala i patologilaboratoriet, men analyser forbliver todimensionelle (2D), da de er begrænset til det samme plan. Ikke-destruktive 3D-teknologier inklusive røntgenmikro- og nanocomputertomografi (nanoCT) har bevist validitet til at forstå anatomiske strukturer, da de tillader vilkårlige betragtningsvinkler og 3D strukturelle detaljer. Imidlertid, lav dæmpning af blødt væv har hæmmet deres anvendelse inden for 3D virtuel histologi. I en nylig undersøgelse, nu offentliggjort den Videnskabelige rapporter , Mark Müller og kolleger ved Institut for Fysik og Bioteknik har udviklet en hæmatein-baseret røntgenfarvningsmetode til specifikt at målrette cellekerner, efterfulgt af demonstrationer på en hel leverlapp af en mus.

Den nye farvningsprotokol kombinerede den nyligt udviklede, højopløsnings nanoCT-system til 3D-visualisering af vævsarkitekturen på nanometerskalaen. Resultaterne afslørede den virkelige 3D-morfologi sammen med rumlig fordeling af cellekerner. Teknikken var også kompatibel med konventionel histologi, da mikroskopiske objektglas med bløddelsprøve kunne farves med den samme protokol sammen med yderligere modfarvning. Metoden demonstrerede muligheden for fremtidige anvendelser inden for histopatologi ledsaget af røntgen-CT-apparater i laboratoriet.

Histologi er den eksisterende guldstandard for en nøjagtig mikroanatomisk diagnose i patologilaboratoriet, teknikker og resultater er dog begrænset til 2D. For eksempel, en 3D-biopsi undersøges normalt ved hjælp af meget tynde mikroskopiske objektglas (indeholdende 2-10 µm tykke skiver) via konventionelle og moderne immunhistokemiske og histologiske farvningsteknikker. Mikro- og nano-CT er kraftfulde værktøjer, der kan give en nøjagtig rekonstruktion af væv i 3D. Udviklingen af ​​teknologien har muliggjort en forholdsvis høj opløsning i forhold til eksisterende 2D konventionel histologi, ved hjælp af enheder lige fra store partikelacceleratorer til laboratoriebaserede røntgenapparater.

Ud over de tekniske krav, Røntgenegnede farvningsmidler (kontrastmidler) såsom fotowolframsyre (PTA), jod kaliumiodid (IKI), jod i ethanol (12E), eller jod i methanol (12M) er også vigtige. De tilgængelige farvningsmidler er dog, i øjeblikket begrænset i omfang og effektivitet. Ved udvikling af næste generations medicinske diagnostik inden for histopatologi, forskere sigter mod at optimere teknikkerne og forstå vævsarkitektur fra celleniveau til vævsskala.

Under den første diagnose i klinisk patologi, cellekernerne og cytoplasmaet er af betydning. Næsten hver histologisk prøve er derfor ofte farvet via standard hæmatoxylin og eosin (H&E) protokol for at identificere kernerne og cytoplasmaet. Men standarder for hæmatoxylinfarvningen er ikke faste, og mange varianter af protokollen eksisterer på grund af forskellige vævstyper og/eller forbehandlingsparametre involveret. Som resultat, Müller et al. introducerede en hæmatein-baseret farvningsprotokol, specielt udviklet til CT, for at muliggøre direkte 3D-visualisering af cellekerner i blødt vævsprøver. Det kraftfulde potentiale af microCT eller nanoCT kombineret med røntgenegnede farvninger vil tillade fremtidig indsigt i vævsorganisation for at forstå sygdom, herunder slidgigt og kræft, ved den cellulære nanoarkitektur.

Ved udvikling af den nye røntgenstråle, hæmatein-baseret farvning, den almindeligt anvendte Mayers hæmatoxylin og Wiegerts jernhæmatoxylin var inkluderet i dens konstitution. Farvningseksperimenterne blev udført på væv fra museleverlobuli, bruges til røntgen-CT-billeddannelse derefter. Den optimerede farvningsprotokol indeholdt fem trin, der startede med kontrolleret syrning af bløddelsprøver under fiksering. Det bløde væv blev fremstillet på molekylært niveau for at farve med hæmatein bly (II) komplekset.

I sin virkningsmekanisme, forskerne viste en styrket ionisk interaktion mellem det positivt ladede hæmatein bly (II) kompleks og den negativt ladede fosfatrygrad i deoxyribonukleinsyren (DNA). Den kemiske reaktion sikrede højere akkumulering af farvningsmidlet i cellekernerne ved at danne et hæmatein bly (II) DNA-kompleks, som et røntgen-egnet middel.

For at sammenligne farvningseffektiviteten, museleverlobuvævet blev afbildet med microCT før farvning, efterfulgt af billeddannelse efter hæmatein-protokol baseret farvning. Farvningsprocessen foregik i to trin, og den ønskede kontrastforøgelse blev opnået som forventet efter farvning. Resultaterne blev observeret ved hjælp af microCT-oversigten til at vise distinkte anatomiske strukturer, herunder vaskulaturen. Farvningen var homogen i hele museleverlappen, i modsætning til tidligere eksempler i store levervævsprøver. 3D-billeddannelsesprocessen tillod adgang til en række CT-skiver i vilkårlige planer. Desuden, i modsætning til konventionel 2D histologi (med paraffinindlejret blødt væv), det bløde væv kunne ses fra forskellige vinkler.

Vævet blev derefter undersøgt på subcellulært niveau med mindre stykker af den samme leverlobuli, som blev dissekeret og analyseret ved hjælp af nanoCT. De visualiserede resultater viste områder af interessevolumen (VOI), cellekerner af hepatocytterne og kerner af andre celletyper (Kupffer-celler og sinusformede endotelceller). Sorte hele strukturer repræsenterede galdekanalnetværket (BC), mens de mørkere grå værdier indikerede cytoplasmaet af levervævsprøven. Orienteringen af ​​BC-netværket blev også observeret. Vævet blev derefter undersøgt med konventionel histologi, ved at bruge meget tynde mikroskopiske objektglas uden anden farvning ud over den påførte hæmateinbaserede farve. Den konventionelle teknik bekræftede ligeledes morfologien af ​​hepatocytter og andre celletyper (kerner farvet i mørk lilla), mens BC-netværket var farvet i hvidt.

Forskerne har sammenlignet bekræftet 3D-data rekonstruktionsnøjagtighed i undersøgelsen med tidligere undersøgelser. Når den hæmatein-baserede procedure blev genanvendt i konventionelle 2D histologiske undersøgelser, forskerne anvendte også en standard modfarvning, eosin Y specifik, til cellens cytoplasma videre til vævet. I resultaterne, cellekernerne forblev lilla, mens cytoplasmaet optog den lyserøde plet. På denne måde forskerne autentificerede den kernespecifikke hæmatein-baserede farvningskapacitet også med standard histologi.

Den hæmatein-baserede farvningsprotokol hjalp højopløsnings CT-visualisering af cellekerner i blødt væv i sub-mikronområdet, hidtil ikke muligt med andre farvningsmetoder, der var kombineret med microCT-teknologi. Fremtidige histopatologiske undersøgelser kan muligvis eliminere tidskrævende forberedelsesprocedurer og tab af vævsprøver (som set med standard histologi) for at opnå individuelle vævsskiver via 3D-undersøgelse af en hel VOI, som vist i nærværende undersøgelse. Evnen til at screene en større prøve for unormale cellekerner kunne hjælpe patologer med at identificere områder med inflammation for at vurdere sygdomsætiologi og progression.

Farvningsprotokollen er enkel og reproducerbar, velegnet til CT-farvning af hele organer, kombineret med 3D-visualisering og dybdegående, ikke-destruktiv analyse af bløddelsprøver. Farvningsmidlerne anført i protokollen er let tilgængelige, mens den kombinerede CT-røntgenprotokol tillader større sofistikering af bløddelsprøveanalyser. Trin i farvningsprotokollen vil kræve yderligere optimering med forskellige vævstyper og i forskellige applikationer, inklusive 3D histologi, udviklings- og strukturbiologiske studier i laboratoriet.

© 2018 Science X Network