Udvidelse af elektron paramagnetisk resonans (EPR) spektroskopi til nanoliter volumen protein enkeltkrystaller

Biokemikere kan bruge elektron paramagnetisk resonans (EPR) på protein-enkeltkrystaller til at bestemme den ultimative elektroniske struktur af paramagnetiske proteinmellemprodukter og undersøge den relative magnetiske tensor til en molekylær struktur. Metoden er, imidlertid, tilbageholdt af typiske proteinkrystaldimensioner (0,05 til 0,3 mm), som ikke giver tilstrækkelig signalintensitet under proteinkrystallografi. I en ny undersøgelse vedr Videnskabens fremskridt , Jason W. Sidabras og et tværfagligt forskerhold i afdelingerne for Chemical Energy Conversion, Fotobioteknologi, Institut for Biologi og Eksperimentel Fysik i Tyskland præsenterede en mikrobølge selvresonant mikrohelix for at kvantificere nanoliterprøver. Forskerne implementerede teknikken i et kommercielt X-bånd (mellemfrekvensfrekvens; 9,5 GHz) EPR-spektrometer. Den selvresonante mikrohelix gav en målt signal-til-støj-forbedring sammenlignet med andre kommercielle EPR-resonatorer. Arbejdet muliggør avancerede EPR-teknikker til at studere protein-enkeltkrystaller til røntgenkrystallografi, uden størrelsesrelaterede udelukkelser eller udfordringer. For at demonstrere metoden, Sidabras et al. brugt enkeltkrystalprotein [FeFe]-hydrogenase (fra Clostridium pasteurianum ) med 0,3 mm gange 0,1 mm gange 0,1 mm dimensioner.

Primær forfatter Jason W. Sidabras, i øjeblikket Marie Sklowdowska-Curie Actions Fellow ved Max Planck Institute for Chemical Energy Conversion i Tyskland, kommenterede endvidere det arbejde, der er udført med forskerne professor Wolfgang Lubitz og Dr. Edward J. Reijerse. "Selvom vi startede med [FeFe]-hydrogenase her, vi har forsøgt at undersøge enkelt-krystal EPR-dynamik i årevis, og den nuværende teknologi er ikke begrænset til overgangsmetaller alene. Metoden defineret i undersøgelsen er anvendelig til at overvåge enhver enzymatisk aktivitet inden for et stabilt proteinmellemprodukt." Han bemærkede endvidere deres mål om at bruge teknologien til at reducere eksisterende omkostninger ved puls EPR-teknologi og erstatte dyre højeffektforstærkere til sparsommelig videnskab (økonomisk omkostningseffektive strategier inden for videnskab).

Forskere bruger typisk EPR-spektroskopi til at undersøge den katalytiske cyklus af redoxenzymer, der indeholder paramagnetiske mellemprodukter, og opnå information om den elektroniske og geometriske struktur af et aktivt enzymatisk sted. Generelt, for at udføre EPR-eksperimenter på proteiner, forskere forbereder en frossen opløsning (koncentration mellem 0,1 til 1 mM) og placerer et volumen (200 µl) i et mikrobølgehulrum for at opnå magnetiske interaktioner på et aktivt sted, med begrænset udsyn til den elektroniske struktur. For fuldt ud at løse de magnetiske tensorinteraktionsparametre, de skal udføre enkeltkrystal EPR-eksperimenter, hvor magnetiske interaktionstensorer kan kombineres med røntgenkrystallografi for at demonstrere proteingeometri og forstå enzymers katalytiske mekanismer. Imidlertid, enkeltkrystal EPR anvendes sjældent på proteinsystemer på grund af udfordringer med at opnå krystaller med passende volumener og størrelser. Mange proteiner i området 0,05 til 0,3 mm er for små til analyse ved brug af kommerciel EPR-instrumentering.

For at forbedre EPJ-følsomheden til at studere enkeltkrystaller, typisk på X-bandet, forskere må opgive design af mikrobølgehulrum og bevæge sig mod resonatorer med lille volumen i mikrobølgeområdet. Strategien kan lette reducerede prøvevolumener fra 200 til 20 µl ved hjælp af en loop-gap-resonator (LGR) og yderligere reduktioner med materialer med høj dielektrisk konstant for at reducere det aktive volumen til en mikroliter. Protein enkeltkrystal undersøgelser kræver endnu yderligere volumenreduktioner (mindre end 0,03 µl), og det kræver en radikal tilgang. For at opnå dette, Sidabras et al. kombineret en selvresonans mikrohelix og en plan mikrokobler på et printkort opsætning, som drev den selvresonante mikrohelix placeret i midten af ​​koblingsløkken. Mikrohelixgeometrien tilbød fordele med en stærkt forbedret mikrobølgefelthomogenitet og højere volumenfølsomhed for små prøver sammenlignet med andre mikroresonatorer. Holdet optimerede den selvresonante mikrohelix til puls- og kontinuerlige bølgeeksperimenter, der kræver meget lidt mikrobølgeeffekt. De matchede og tunede let mikrohelixen på tværs af en række prøver og temperaturer.

I nærværende arbejde, holdet brugte den selvresonante mikrohelix til at undersøge EPR-krystalrotation af [FeFe]-hydrogenase i den aktive oxiderede tilstand (H _OKSE ; krystaldimensioner 3 mm gange 0,1 mm gange 0,1 mm), fra Clostridium pasteurianum (anaerob bakterie). De udførte avancerede puls EPR-eksperimenter på strukturen for at observere fremragende signal-til-støj-forhold. Dataene demonstrerede brugen af ​​mikrohelixen til at studere enkeltkrystalproteiner ved volumener passende til røntgenkrystallografi. Under forsøg, forskerholdet viklede den selvresonante mikrohelixgeometri omkring en 0,4 mm kapillar og fastgjorde samlingen til en specialindsats, der var kompatibel med kommercielle EPR-systemer. De udførte et kontinuerligt bølge EPR-eksperiment ved hjælp af en frossen opløsning og forbedrede signal-til-støj-forholdet (SNR) af arbejdet ved hjælp af et felt-swept nonadiabatic rapid scan (NARS) eksperiment.

De brugte en langlivet tyrosin D radikal (Y∙D) som en standardprobe under eksperimenter med tidligere velkarakteriserede egenskaber. For at generere tyrosin-radikal (Y∙D) EPR-signal, holdet belyste prøver af fotosystem II-kernekomplekset (membranproteinkompleks) i omgivende lys og nedfryste dem hurtigt. De udførte flere eksperimenter for at demonstrere alsidighed af mikrohelixen under EPR-målinger på tværs af en række prøver (mindre end 85 nanoliter i volumen) ved X-bånd. Sidabras et al. brugte fotosystem II-krystallerne som et benchmark på trods af dets udfordrende sammensætning. Strukturelt set, fotosystem II-komplekset indeholdt en molekylmasse på ca. 350 kDa, hvor hver komponent kun indeholdt et Y∙D-radikal. I alt, med otte fotosystem II-komplekser pr. enhedscelle beregnede forskerne 8,9 x 10 ¹² Y∙D radikale, at demonstrere EPJ-metodens alsidighed til at studere store komplekser i små krystaldimensioner.

Efter at have fastslået egnetheden af ​​den selvresonante mikrohelix til at studere enkeltkrystalproteinprøver, holdet udvidede arbejdet for at demonstrere fuld vinkel-g-tensorbestemmelse (energiskift forbundet med molekylær overgang) og til at undersøge avancerede puls-EPR-eksperimenter såsom elektronspin-ekko-indhyllingsmodulation (ESEEM) eller hyperfin sublevel-korrelation (HYSCORE). De optimerede den selvresonante mikrohelix til disse eksperimenter. Team field-swept to-puls ESE (electron spin echo) EPR eksperimenter på en protein-enkeltkrystal af [FeFe]-hydrogenase af C. pasteurianum (Cpl) i det oxiderede H _OKSE tilstand i et anerobt kammer under et mikroskop for at optage proteinkrystaller via kapillærvirkning i et kapillarrør.

De inkluderede derefter kryobeskyttelsesmiddel og medier i mikrohelixen efterfulgt af flash-frysning for at producere et EPR-signal med fire forskellige signaler i spektret i forhold til proteinstrukturen. Forskerne indpassede dataene i simuleringer relateret til forskellige referencerammer defineret via EasySpin-simuleringspakken til EPR-spektrumsimulering. Holdet lavede et skema, der relaterer [FeFe]-hydrogenase H-cluster molekylrammen til laboratoriesystemets ramme. For alle arter undersøgt i forsøgene, holdet bestemte g-tensor-størrelsen og -orienteringen ved hjælp af ligand-feltteori og verificerede resultaterne ved hjælp af kvantekemiske beregninger. Holdet faciliterede grundlæggende indsigt i den elektroniske struktur og noterede deres afhængighed af ligandsfæren og observerede nødvendigheden af ​​optimerede strategier.

The researchers illustrated more advanced experiments for single-crystal studies using HYSCORE (hyperfine sublevel correlation) experiments for the ESE (electron spin echo) EPR dataset. For det, they obtained a single-crystal 2-D spectrum for the H-cluster in [FeFe]-hydrogenase crystals and identified six main transitions. Sidabras et al. highlighted the feasibility of these advanced EPR techniques in the present work and related them to the electronic structure predicted using quantum chemical calculations. The team aim to address additional molecular couplings of ligands in depth using ESEEM/HYSCORE techniques in the future.

På denne måde Jason W. Sidabras and colleagues presented an advanced resonator to design and collect EPR data from a 3 mm by 0.1 mm by 0.1 mm single crystal of [FeFe]-hydrogenase in the H _OX state from C. pasteurianum (Cpl). The HYSCORE spectra obtained from a protein single crystal in the present work were a first in study. Additional work proposed by the team will facilitate further insight for protein engineering and artificial enzyme research to create bioinspired and biomimetic enzymatic systems. Især the self-resonant microhelix engineered in the work can allow biochemists to study diverse catalytically active proteins at crystal dimensions relative to X-ray crystallography, which will pave the way for significant advancements in the field of enzyme research.

© 2019 Science X Network