Selvjusterende mikroskop smadrer grænserne for superopløsningsmikroskopi

Et ultrapræcis mikroskop, der overgår begrænsningerne for Nobelprisvindende superopløsningsmikroskopi, vil lade forskere direkte måle afstande mellem individuelle molekyler.

UNSW medicinske forskere har opnået hidtil usete opløsningsevner i enkeltmolekylemikroskopi for at detektere interaktioner mellem individuelle molekyler i intakte celler.

2014 Nobelprisen i kemi blev tildelt for udviklingen af ​​super-opløsning fluorescensmikroskopi-teknologi, der gav mikroskopister den første molekylære visning inde i celler, en evne, der har givet nye molekylære perspektiver på komplekse biologiske systemer og processer.

Nu er grænsen for detektion af enkelt-molekyle mikroskoper blevet smadret igen, og detaljerne er offentliggjort i det aktuelle nummer af Videnskabens fremskridt .

Mens individuelle molekyler allerede kunne observeres og spores med superopløsningsmikroskopi, interaktioner mellem disse molekyler forekommer i en skala, der er mindst fire gange mindre end den, der opløses af eksisterende enkeltmolekylemikroskoper.

"Grunden til, at lokaliseringspræcisionen af ​​enkeltmolekylemikroskoper normalt er omkring 20-30 nanometer, er fordi mikroskopet faktisk bevæger sig, mens vi registrerer det signal. Dette fører til en usikkerhed. Med de eksisterende superopløsningsinstrumenter, vi kan ikke sige, om et protein er bundet til et andet protein, fordi afstanden mellem dem er kortere end usikkerheden på deres positioner, siger Scientia-professor Katharina Gaus, forskningsteamleder og leder af UNSW Medicines EMBL Australia Node i Single Molecule Science.

For at omgå dette problem, holdet byggede autonome feedback-loops inde i et enkelt-molekyle mikroskop, der detekterer og genjusterer den optiske vej og scene.

"Det er lige meget, hvad du gør ved dette mikroskop, den finder dybest set tilbage med præcision under en nanometer. Det er et smart mikroskop. Den gør alle de ting, som en operatør eller en servicetekniker skal gøre, og det gør den 12 gange i sekundet, siger professor Gaus.

Måling af afstanden mellem proteiner

Med det design og de metoder, der er beskrevet i papiret, feedbacksystemet designet af UNSW-teamet er kompatibelt med eksisterende mikroskoper og giver maksimal fleksibilitet til prøveforberedelse.

"Det er en virkelig enkel og elegant løsning på et stort billeddannelsesproblem. Vi har lige bygget et mikroskop i et mikroskop, og alt det gør er at justere hovedmikroskopet. At den løsning, vi fandt, er enkel og praktisk, er en reel styrke, da den ville tillade nem kloning af systemet, og hurtig indførelse af den nye teknologi, siger professor Gaus.

For at demonstrere nytten af ​​deres ultra-præcise feedback enkeltmolekyle mikroskop, forskerne brugte det til at udføre direkte afstandsmålinger mellem signalproteiner i T-celler. En populær hypotese inden for cellulær immunologi er, at disse immunceller forbliver i en hvilende tilstand, når T-cellereceptoren er ved siden af ​​et andet molekyle, der fungerer som en bremse.

Deres højpræcisionsmikroskop var i stand til at vise, at disse to signalmolekyler faktisk er yderligere adskilt fra hinanden i aktiverede T-celler, slippe bremsen og tænde for T-cellereceptorsignalering.

"Konventionelle mikroskopiteknikker ville ikke være i stand til nøjagtigt at måle en så lille ændring, da afstanden mellem disse signalmolekyler i hvilende T-celler og i aktiverede T-celler kun afveg med 4-7 nanometer, siger professor Gaus.

"Dette viser også, hvor følsomme disse signaleringsmaskiner er over for rumlig adskillelse. For at identificere reguleringsprocesser som disse, vi skal udføre præcise afstandsmålinger, og det er, hvad dette mikroskop muliggør. Disse resultater illustrerer potentialet i denne teknologi for opdagelser, som ikke kunne gøres på nogen anden måde."

Postdoc forsker, Dr. Simao Pereira Coelho, sammen med ph.d. studerende Jongho Baek — som siden er blevet tildelt sin ph.d. grad - ledet designet, udvikling, og opbygning af dette system. Dr. Baek modtog også Dean's Award for Outstanding Ph.D. Speciale til dette arbejde.