Multicolor super-opløsning billeddannelse gjort let

Forskere ved EPFL har udviklet robust og let at implementere multifarve super-opløsning billedbehandling. Fremgangsmåden er baseret på den samtidige erhvervelse af to spektrale kanaler efterfulgt af spektral krydskumulantanalyse og afblanding. De udnytter fluoroforblink og spektral krydstale til generering af yderligere farvekanaler med superopløste billeder.

Flerfarvet fluorescensmikroskopi er et vigtigt værktøj for biovidenskaberne til at studere de relative arrangementer af cellulære strukturer eller interaktionerne mellem forskellige proteiner. Imidlertid, konventionelle mikroskoper, arbejdshestene til mange biologiske undersøgelser, kan kun løse detaljer i rækkefølgen af ​​lysets bølgelængde. I de sidste to årtier, adskillige superopløsningsmikroskopikoncepter hjalp forskere med at overvinde denne diffraktionsgrænse og med at gøre nye opdagelser. Disse nye metoder finder kun langsomt vej til rutinemæssige biologiske anvendelser. For nogle af de nye teknikker, dette skyldes kompleks mikroskop hardware, men også øgede krav til prøveforberedelse og fluorescerende etiketter udgør betydelige forhindringer. Kravene til vellykket super-opløsning billeddannelse er endnu mere udfordrende at opfylde for flerfarve applikationer.

EPFL's Laboratory of Biomedical Optics ledet af Theo Lasser har arbejdet indgående på Super-resolution Optical Fluctuation Imaging (SOFI) for at øge den rumlige opløsning og sampling i 2-D og 3-D. SOFI er et alternativ til enkelt-molekyle lokaliseringsmikroskopi teknikker såsom STORM og PALM. Den analyserer højere ordens spatio-temporale statistikker af en tidsserie af blinkende fluoroforer og kræver ikke isolering af individuelle fluoroforers emissioner. SOFI er kompatibel med en bredere vifte af mærknings- og billeddannelsesforhold, hvilket forenkler fluoroforvalg og eksperimenter. I deres nye undersøgelse, forskere ved School of Engineering ledet af Theo Lasser og Aleksandra Radenovic (leder af Laboratory of Nanoscale Biology) udvidede den statistiske analyse til det spektrale domæne for at bane vejen mod en ny tilgang til multicolor super-opløsning billeddannelse.

Antallet af farver er ikke begrænset af mikroskopets spektrale kanaler eller udnyttelse af spektral krydstale

Ideen bag den flerfarvede SOFI-tilgang er følgende. Ved klassisk flerfarvet billeddannelse bør krydstale mellem forskellige spektralkanaler i mikroskopet undgås. Her, forskerne udnytter krydstale til at generere yderligere farvekanaler. De anvender krydskumulant analyse mellem flere samtidig erhvervede spektralkanaler. Den statistiske analyse giver dem mulighed for at supplere de fysiske detektionskanaler, som mikroskopet leverer, med yderligere virtuelle spektralkanaler. "Kun de signaler, der er rumligt og tidsmæssigt korrelerede i de forskellige spektrale kanaler, vil dukke op i de virtuelle kanaler. Vi opfanger præcis den krydstale, som alle andre gerne vil af med." forklarer Kristin Grußmayer, en af ​​studiets hovedforfattere. De yderligere beregningsmæssigt genererede spektralkanaler sammen med lineær unmixing muliggør billeddannelse af mere distinkte fluoroforfarver end registrerede fysiske detektionskanaler.

Publikationen giver teorien bag spektral krydskumulant flerfarvet SOFI og inkluderer en ramme til at optimere mikroskopets spektrale kanaler for en given kombination af fluoroforer, der skal afbildes. Simulerede datasæt hjalp teamet med at verificere, at deres nye flerfarvetilgang skulle fungere til en bred vifte af etiketter med forskellige fotofysiske egenskaber, selv for dem med stærkt overlappende emissionsspektre. "Vi kunne vise, at vores tilgang virker til tre-farve-billeddannelse i faste og i levende celler for en række forskellige farvestoffer og fluorescerende proteiner. Billeddannelsen kan udføres ved hjælp af kommercielle widefield-opsætninger med to-kanals billedopdelingsenheder, der er bredt tilgængelige. I princippet , vi er ikke begrænset til 3 farver." siger Kristin Grußmayer.

Instruktioner til udførelse af flerfarvet spektral krydskumulant SOFI-analyse er tilgængelig på hjemmesiden for Laboratory of Nanoscale biology under www.epfl.ch/labs/lben/sofi-packages/, og softwarepakken kan downloades på www.epfl.ch/ labs/lben/wp-content/uploads /2020/05/multicolor_sofi_v2.3.zip .