Mikroskopigennembrud afslører, hvordan proteiner opfører sig i 3-D

For seks år siden, Nobelprisen i kemi blev tildelt tre videnskabsmænd for at finde måder at visualisere individuelle molekylers veje inde i levende celler.

Nu, forskere ved University of Rochester og Fresnel Institute i Frankrig har fundet en måde at visualisere disse molekyler i endnu flere detaljer, viser deres position og orientering i 3D, og endda hvordan de slingrer og svinger. Arbejdet kunne kaste uvurderlig indsigt i de involverede biologiske processer, for eksempel, når en celle og de proteiner, der regulerer dens funktioner, reagerer på den virus, der forårsager COVID-19.

"Når et protein ændrer form, det blotlægger andre atomer, der forbedrer den biologiske proces, så ændringen af ​​et proteins form har en enorm effekt på andre processer inde i cellen, " siger Sophie Brasselet, direktør for Fresnel Institute, som samarbejdede med Miguel Alonso og Thomas Brown, begge professorer i optik ved Rochester.

Tilnavnet CHIDO - for "Coordinate and Height super-resolution Imaging with Dithering and Orientation" - teknologien er beskrevet i et nyt papir offentliggjort i Naturkommunikation . Designet og bygget af hovedforfatterne Valentina Curcio, en ph.d. elev i Brasselets gruppe, og Luis Aleman-Castaneda, en ph.d. elev i Alonsos gruppe, CHIDO er præcis inden for "tivis af nanometer i position og nogle få graders orientering" til at bestemme parametrene for enkelte molekyler, " fortæller holdet.

Ved at bruge en glasplade, der er udsat for ensartet belastning rundt om dens periferi, enheden kan skabe og ekstrapolere bølgelængdeoscillationer og ændringer i polarisering, der opstår, når molekyler observeres i et fluorescensmikroskop. Den nye teknologi forvandler billedet af et enkelt molekyle til et forvrænget brændpunkt, hvis form direkte koder mere præcis 3D-information end tidligere måleværktøjer. Træde i kræft, CHIDO kan producere stråler, der har enhver mulig polarisationstilstand.

"Dette er en af ​​optikkens skønheder, " siger Brown. "Hvis du har en enhed, der kan skabe næsten enhver polarisationstilstand, så har du også en enhed, der kan analysere stort set enhver mulig polarisationstilstand."

Glaspladen opstod i Browns laboratorium som en del af hans lange interesse i at udvikle bjælker med usædvanlige polariseringer. Alonso, en ekspert i teorien om polarisering, arbejdet sammen med Brown om måder at forfine denne "meget enkle, men meget elegante enhed" og udvide dens applikationer. Under et besøg i Marseille, Alonso beskrev pladen til Brasselet, en ekspert i ny instrumentering til fluorescens og ikke-lineær billeddannelse. Brasselet foreslog straks dets mulige anvendelse i de mikroskopiteknikker, hun arbejdede på for at afbilde individuelle molekyler.

"Det har været et meget komplementært hold, siger Brasselet.

20 år undervejs

I 1873, Ernst Abbe fastsatte, at mikroskoper aldrig ville opnå bedre opløsning end halvdelen af ​​lysets bølgelængde. Den barriere stod, indtil nobelprismodtagerne Eric Betzig og William Moerner - med deres enkeltmolekylemikroskopi - og Stefan Hell - med sin stimulerede emissionsudtømningsmikroskopi - fandt måder at omgå det.

"På grund af deres resultater kan det optiske mikroskop nu kigge ind i nanoverdenen, " rapporterede Nobelkomiteen i 2014.

"Det, der manglede i den nobelpris og arbejdet i de efterfølgende år, var evnen til ikke blot at kende et molekyles placering nøjagtigt, men for at kunne karakterisere dens retning og især dens bevægelse i tre dimensioner, " siger Brown.

Faktisk, løsningen Brown, Alonso, og Brasselet nu beskriver havde sin oprindelse for 20 år siden.

Fra 1999, Brown og en af ​​hans ph.d. studerende, Kathleen Youngworth, begyndte at undersøge usædvanlige optiske stråler, der viste usædvanlige mønstre af optisk polarisering, orienteringen af ​​den optiske bølge. Nogle af bjælkerne udviste et egerlignende radialt mønster med spændende egenskaber.

Youngworth demonstrerede på en bordplade, at når man er tæt fokuseret, strålerne udviste polarisationskomponenter, der pegede i næsten alle retninger i tre dimensioner.

Alexis Spilman Vogt, endnu en ph.d. kandidat, arbejdede derefter sammen med Brown om at skabe de samme effekter ved at påføre spænding på kanterne af en glascylinder. Browns svoger, Robert Sampson, en dygtig værktøjs- og matricespecialist, blev opfordret til at fremstille nogle prøver og passe dem i metalringe til brug med et konfokalt mikroskop.

Dette indebar opvarmning af både glas- og metalringene. "Metal udvider sig hurtigere, når du opvarmer det, end glas gør, "Brown siger, "og så du kunne varme glasset og metallet op meget varmt, indsæt glasset i midten af ​​metallet, og når det afkøles, ville metallet krympe og skabe en enorm kraft på glassets periferi."

Sampson påførte utilsigtet mere stress end krævet med en af ​​pladerne. Så snart hans svoger rakte ham den, Brown vidste, at pladen havde usædvanlige kvaliteter. Rochester-gruppen introducerede udtrykket "stress manipuleret optik" for at beskrive elementerne og, efterhånden som de lærte mere om både den fysiske adfærd og matematikken, de indså, at vinduerne kunne være vejen til at løse helt nye problemer i mikroskopi.

Og det var oprindelsen til det, der nu er CHIDO, hvilken, tilfældigvis, tilfældigvis er mexicansk slang for "cool".

"På det tidspunkt vidste Alexis og jeg, at det stress-konstruerede glas var interessant, og vil sandsynligvis have nyttige applikationer; vi vidste bare ikke på det tidspunkt, hvad de kunne være, " siger Brown. Nu, takket være hans samarbejde med Alonso og Brasselet, han håber, at CHIDO vil "fange fantasien" hos andre forskere på området, som kan hjælpe med at forfine og anvende teknologien yderligere.