Ny mikroskopiteknik gør dyb in vivo hjernebilleddannelse mulig

En banebrydende teknik udviklet af Prevedel Group på EMBL giver neuroforskere mulighed for at observere levende neuroner dybt inde i hjernen - eller enhver anden celle skjult i et uigennemsigtigt væv. Teknikken er baseret på to avancerede mikroskopimetoder, tre-foton mikroskopi og adaptiv optik. Papiret, der rapporterer om dette fremskridt, blev offentliggjort den 30. september 2021 i Naturens metoder .

Indtil udviklingen af ​​den nye teknik, det var udfordrende for neurovidenskabsmænd at observere astrocytter, der genererede calciumbølger i dybe lag af cortex, eller at visualisere andre neurale celler i hippocampus, en region dybt i hjernen, der er ansvarlig for rumlig hukommelse og navigation. Fænomenet finder sted regelmæssigt i hjernen hos alle levende pattedyr. Ved at udvikle den nye teknik, Lina Streich fra Prevedel Group og hendes samarbejdspartnere var i stand til at fange de fine detaljer i disse alsidige celler med hidtil uset høj opløsning. Det internationale hold omfattede forskere fra Tyskland, Østrig, Argentina, Kina, Frankrig, USA, Indien, og Jordan.

I neurovidenskaberne, hjernevæv observeres for det meste i små modelorganismer eller in ex vivo prøver, der skal skæres op for at blive observeret - som begge repræsenterer ikke-fysiologiske forhold. Normal hjernecelleaktivitet finder kun sted i levende dyr, men "musehjernen er et stærkt spredende væv, " sagde Robert Prevedel. "I disse hjerner, lys kan ikke fokuseres særlig let, fordi det interagerer med de cellulære komponenter. Dette begrænser, hvor dybt du kan generere et skarpt billede, og det gør det meget svært at fokusere på små strukturer dybt inde i hjernen med traditionelle teknikker."

Tak til Streich, en tidligere ph.d.-studerende i laboratoriet, der arbejdede i mere end fire år for at overvinde dette problem, forskere kan nu kigge længere ind i væv.

"Med traditionelle fluorescens-hjernemikroskopiteknikker, to fotoner absorberes af fluorescensmolekylet hver gang, og du kan sikre dig, at spændingen forårsaget af strålingen er begrænset til et lille volumen, " forklarede Prevedel, uddannet fysiker. "Men jo længere fotonerne rejser, jo mere sandsynligt er de tabt på grund af spredning." En måde at overvinde dette på er at øge bølgelængden af ​​de spændende fotoner mod det infrarøde, som sikrer nok strålingsenergi til at blive absorberet af fluoroforen. Ud over, at bruge tre fotoner i stedet for to giver mulighed for at få skarpere billeder dybt inde i hjernen. Men en anden udfordring er tilbage:at sikre, at fotonerne er fokuseret, så hele billedet ikke er sløret.

Det er her den anden teknik, som Streich og hendes hold bruger, er vigtig. Adaptiv optik bruges regelmæssigt i astronomi - og det var faktisk afgørende for Roger Penrose, Reinhard Genzel og Andrea Ghez får Nobelprisen i fysik i 2020 for deres opdagelse af sorte huller. Astrofysikere bruger deformerbare, computerstyrede spejle til i realtid at korrigere for forvrængning i lysbølgefronten forårsaget af atmosfærisk turbulens. I Prevedels laboratorium, forvrængningen er forårsaget af spredningen af ​​inhomogene væv, men princippet og teknologien er meget ens. "Vi bruger også et aktivt styret deformerbart spejl, som er i stand til at optimere bølgefronterne for at tillade lyset at konvergere og fokusere selv dybt inde i hjernen, " forklarede Prevedel. "Vi udviklede en tilpasset tilgang til at gøre den hurtig nok til at bruge på levende celler i hjernen, " tilføjede Streich. For at reducere invasiviteten af ​​teknikken, holdet minimerede også antallet af målinger, der var nødvendige for at opnå billeder i høj kvalitet.

"Det er første gang, disse teknikker er blevet kombineret, sagde Streich, "og tak til dem, vi var i stand til at vise de dybeste in vivo billeder af levende neuroner i høj opløsning." Forskerne, som arbejdede i samarbejde med kolleger fra EMBL Rom og Universitetet i Heidelberg, selv visualiserede dendritter og axoner, der forbinder neuronerne i hippocampus, mens hjernen efterlades fuldstændig intakt.

"Dette er et spring i retning af at udvikle mere avancerede ikke-invasive teknikker til at studere levende væv, " sagde Streich. Selvom teknikken blev udviklet til brug på en musehjerne, det er let at anvende på ethvert uigennemsigtigt væv. "Udover den åbenlyse fordel ved at være i stand til at studere biologiske væv uden at skulle ofre dyrene eller fjerne overliggende væv, denne nye teknik åbner vejen for at studere et dyr i længderetningen, det er, fra begyndelsen af ​​en sygdom til slutningen. Dette vil give forskerne et stærkt instrument til bedre at forstå, hvordan sygdomme udvikler sig i væv og organer."