Den nye analysemetode i rekordhøj hastighed DNA-analyseanordning

Molekylær diagnostik spiller en stadig vigtigere rolle i medicin til påvisning af genetiske sygdomme, overvågning af effektiviteten af ​​kræftbehandling, og i kampen mod aggressive bakterieinfektioner. Nysgerrighedsdiagnostik (CD), en virksomhed, der tilhører Scope Fluidics-gruppen, har udviklet en ny teknik til DNA-analyse:synergistisk PCR (sPCR). Metoden, beskrevet detaljeret i fællespublikationen af ​​CD- og IPC PAS-forskere i Videnskabelige rapporter kombinerer fordelene ved to af nutidens mest populære genetiske kodeanalyseteknikker og kan udføres på bredt tilgængelige instrumenter.

"Den DNA-analyseteknik, vi foreslår, blev født under udviklingen af ​​det innovative PCR|ONE-analyseinstrument, som kan bruges til at teste den genetiske kode på kun syv minutter. Dette er mere end ti gange kortere tid, end det kræves i klassiske løsninger, " siger prof. Piotr Garstecki (IPC PAS, CD).

Prøver, der sendes til DNA-analyser, indeholder normalt så lidt genetisk materiale, at deres analyse ved hjælp af konventionelle laboratorieteknikker ikke ville være mulig. Efter at have fjernet urenheder fra prøven, det første trin er at øge mængden af ​​genetisk materiale, ofte op til en milliard gange. polymerasekædereaktion (PCR) anvendes til dette formål.

PCR-reaktionen involverer cyklisk opvarmning og afkøling af en opløsning, der indeholder det genetiske materiale, der amplificeres, og de passende reagenser:en polymerase (dvs. enzymet, der katalyserer reaktionen af ​​DNA-syntese), de nukleotider, der er nødvendige for at bygge DNA-strengen, og primere, dvs. korte DNA -fragmenter, der er i stand til at vedhæfte begyndelsen og slutningen af ​​det formerede kodefragment (f.eks. et specifikt gen). Hver PCR -cyklus består af varme- og kølefaser. I den første fase, ved en temperatur på omkring 95 grader celsius, brintbroerne knækker, og den hidtil dobbeltstrengede DNA-kæde splittes i to enkeltstrenge. I den kølige fase, ved en temperatur på omkring 50 grader, primerne fra opløsningen fastgøres til de tilsvarende steder på trådene, hvorefter polymerasen bygger en komplementær tråd imellem dem. I slutningen af ​​hver cyklus, der er (under ideelle forhold) dobbelt så mange dobbeltstrengede DNA-fragmenter som i begyndelsen.

PCR bruges til at detektere specifikke fragmenter af den genetiske kode og til at estimere den oprindelige mængde genetisk materiale. Kvantitative målinger udføres normalt ved hjælp af en analog teknik kendt som real-time PCR. Prøven opformeres, og i efterfølgende cyklusser, mængden af ​​DNA kontrolleres ved hjælp af fluorescerende farvestoffer. Når intensiteten af ​​ændringerne overstiger en fastsat tærskel, den oprindelige mængde af genetisk materiale er estimeret ud fra antallet af cyklusser. Den analoge PCR-teknik er forholdsvis ligetil, men på grund af PCR's følsomhed over for selv enkelte partikler af urenheder, det kræver forsigtighed, kontinuerlig kalibrering.

En anden metode er digital PCR. Prøven er opdelt i titusinder eller hundredtusinder, og nogle gange endda millioner af partitioner med samme volumen. Derefter, i hver partition, proceduren for duplikering af genetisk materiale udføres, og der kontrolleres, hvis den indstillede ændring viser sig. Under deling af prøve-DNA'et, molekyler når kun nogle skillevægge, så ændringen sker ikke alle steder. Den oprindelige mængde DNA kan derfor estimeres ud fra antallet af registrerede signaler. Fordelen ved digital teknologi er, at der ikke er behov for at kalibrere enheden. Imidlertid, på grund af behovet for at udføre et stort antal reaktioner parallelt, testudstyret er dyrt og er ikke så almindeligt i laboratorier som analoge PCR-apparater.

Synergistisk PCR, teknikken foreslået af CD og IPC PAS, kombinerer de vigtigste fordele ved de analoge og digitale metoder. For at opnå pålidelige målinger, det er nok at fortynde en prøve til kun et dusin, eller højst flere dusin skillevægge. Denne metode kræver ikke kalibrering.

"Et lille antal partitioner, karakteristisk for vores teknik, er af særlig praktisk betydning. Det betyder, at for at udføre analysen, alt, der er brug for, er standardbrøndpladeformatet, der bruges i populære analoge PCR-enheder, " siger Pawel Debski, en IPC PAS ph.d.-studerende, der udviklede sPCR-metoden hos Curiosity Diagnostics.

På grund af et lille antal prøvepartitioner, sPCR-teknikken er lettere at udføre og lidt hurtigere end digitale varianter. Sammenlignet med analoge teknikker, imidlertid, Der kræves flere reagenser. Af denne grund, det vil ikke erstatte den analoge variant, ifølge forskerne. Imidlertid, det kan være en værdifuld tilføjelse, fordi den ikke behøver nogen kalibrering, således at laboratoriepersonalet kan kontrollere rigtigheden af ​​analoge målinger uafhængigt.

"Vores DNA-testteknik er blevet patenteret. vi ønsker at understrege friheden ved at bruge det til ikke-kommercielle formål. Og da den bruger typiske, populært gentestudstyr, alt du skal gøre for at komme i gang er at nå ud til vores artikel, " fremhæver prof. Garstecki.

I standard PCR-maskiner, relativt langsom varmediffusion mellem prøven og en tilstødende stor blok af skiftevis opvarmet eller afkølet materiale bruges til at opvarme og afkøle det genetiske materiale. I PCR|ONE, infrarød stråling bruges til hurtigt at opvarme prøven. Diffusionskølingsmekanismen er også blevet ændret:blokken, der bruges til dette formål, er mindre end i konventionelle instrumenter, og den holdes konstant, strengt kontrolleret temperatur. Som et resultat af de tekniske og analytiske forbedringer, prototyperne af PCR|ONE er i stand til at gennemføre DNA-assays på mindre end et kvarter, og selve PCR'en tager kun syv minutter. De første PCR | ONE -enheder vil sandsynligvis komme på markedet om to til tre år.