Nye fluorescerende farvestoffer kunne fremme biologisk billeddannelse

Med en ny teknik til at lave et spektrum af glødende farvestoffer, kemikere jagter ikke længere regnbuer.

Udskiftning af specifikke kemiske byggesten i fluorescerende molekyler kaldet rhodaminer kan generere næsten enhver farve, forskere ønsker - ROYGBIV og videre, forskere rapporterer 4. september, 2017 i journalen Naturmetoder .

Arbejdet tilbyder forskere en måde at bevidst justere egenskaberne af eksisterende farvestoffer, gør dem modigere, lysere, og mere cellepermeabel også. En sådan udvidet palet af farvestoffer kunne hjælpe forskere med bedre at belyse cellernes indre virke, siger studieleder Luke Lavis, en gruppeleder på Howard Hughes Medical Institute's Janelia Research Campus i Ashburn, Virginia. Hans team oplyste cellekerner, fik larvefrugtfluehjerner til at skinne, og fremhævede visuelle cortex neuroner i mus, der havde bittesmå glasvinduer monteret i deres kranier.

Forskere plejede at sammensætte forskellige farvestoffer hovedsageligt ved forsøg og fejl, Siger Lavis. "Nu, vi har fundet ud af reglerne, og vi kan lave næsten enhver farve. "Hans teams metode kunne tillade kemikere at syntetisere hundredvis af forskellige farver.

En lys historie

Indtil for omkring 20 år siden, forskere stolede på kemiske fluorescerende farvestoffer for at gøre biologiske molekyler synlige. For at kigge inde i celler, farvning af organeller, og andre billeddannelseseksperimenter, "Kemi var konge, "Lavis skrev i en 13. juli, 2017 perspektiv i journalen Biokemi . Og så, kongen blev sparket af tronen - af et glødende grønt vandmandsprotein kaldet GFP.

I 1994, forskere rapporterede brugen af ​​et genetisk trick til at bekæmpe GFP, det grønne fluorescerende protein, på andre cellulære proteiner; det er som at tvinge proteinerne til at holde en glødestav. Det trick gav forskere en enklere måde at spore proteiners bevægelser under et mikroskop - uden at bruge dyre syntetiske farvestoffer. Innovationen flammede gennem biologisk billeddannelse. I 2007, forskernes blanding af GFP og to andre fluorescerende proteiner lader dem male musens neuroner en parade med levende farver i en teknik kendt som "Brainbow". Et år senere, opdagelsen og udviklingen af ​​GFP tjente Nobelprisen i kemi for tre forskere, herunder afdøde Roger Tsien, en HHMI -efterforsker.

Men GFP har også nogle mørke sider. Det er et relativt klumpet molekyle bygget op af det begrænsede sæt af naturlige aminosyrer. Så GFP er ikke altid lys nok til at afsløre, hvad forskere forsøger at se.

Så forskere vendte tilbage til kemi. Forskere havde udviklet banebrydende mikroskoper og nye teknikker til at mærke mobilindhold, Lavis siger, men farvestofferne til markering af molekyler inde i celler sad stadig fast i det nittende århundrede. Hans team fokuserede på rhodaminer, fordi de er særligt lyse og cellegennemtrængelige - så de glider let ind i cellerne og får dem til at lyse. Men på trods af at have arbejdet med rhodaminer i mere end 100 år, kemikere havde kun skabt et par dusin farver, og de fleste var lignende nuancer lige fra grøn til orange.

Indtil for nylig, at lave nye rhodaminer var ikke let. Forskere brugte stadig teknikker fra de tidligste dage i kemi, kogende kemiske ingredienser i svovlsyre. Dette tvinger molekylerne til at kæde sammen i det, der kaldes en kondensationsreaktion. Blanding af forskellige byggesten kan give nye og usædvanlige farvestoffer. Men ingredienserne skulle være hårde nok til at overleve det kogende syrebad - hvilket ikke efterlod mange muligheder.

Få det til at lyse

I 2011, Lavis 'team udviklede en ny måde at pille ved rhodamines struktur, under mildere forhold. Ved hjælp af en reaktion udløst af metalpalladium, forskerne kunne springe syretrinnet over og konstruere farvestoffer med mere komplicerede byggesten, end man havde brugt før.

Denne venligere, mildere tilgang åbnede døren til en bred ny verden af ​​farvestoffer, og Lavis 'team dukkede ind. Fire år senere, de afslørede Janelia Fluor -farvestofferne, fluorescerende molekyler op til 50 gange lysere end andre farvestoffer, og mere stabil også. Hemmeligheden bag Janelia Fluor -farvestofferne er et lille firkantet vedhæng kaldet en azetidinring - en struktur, der kun er muliggjort af Lavis nye kemi -tilgang.

Forskere kan bruge en række strategier til at få de lyse farvestofmolekyler på det protein, de vil studere. Derefter, de kan nulstille på det oplyste protein, og se det vrikke rundt og interagere med andre molekyler - uden den sædvanlige uklarhed i baggrunden.

"For os, det var en total revolution inden for enkeltmolekylær billeddannelse, "siger molekylærbiologen Xavier Darzacq fra University of California, Berkeley. Inden brug af Janelia Fluor -farvestoffer, de fluorescerende mærkede transkriptionsfaktorproteiner, hans team undersøgte, var for svage til at fange i skarpe billeder. Forskere måtte holde kameraets lukker åben i 10 millisekunder for at indsamle nok lys. Det er længe nok til at proteiner kan vandre, så billedet ville komme sløret ud - som et fotografi af et skævt lille barn. Men Janelia -farvestofferne er lyse nok til, at hans team kan fange molekyler i aktion på bare et millisekund, Siger Darzacq. Sådanne hurtige øjebliksbilleder har givet sit team mulighed for at lave laboratorieeksperimenter, han beskriver som "simpelthen utænkeligt for et par år siden."

Nu, Lavis gruppe har fundet ud af at finjustere deres fluorescerende farvestoffer, ved at tilpasse rhodamines struktur endnu mere. Rhodaminer har et grundlæggende fire-ringet design med grupper af atomer, der stikker ud fra forskellige dele af ringene. I tidligere arbejde, forskerne udviklede strategier til groft tuning farvestoffer - snip et helt vedhæng ud her, og du kan lave et grønt farvestof. Pop i et siliciumatom der, og du er rød. Lavis opdagede, at ved omhyggeligt at placere et par nye atomer i farvestrukturen, farvestoffernes farve og kemiske egenskaber kan også finjusteres, tillader mange grønne nuancer fra et enkelt stillads. Det er som at gå fra den klassiske otte pakke farveblyanter til jumbokassen med 64.

I et separat papir, offentliggjort 9. august 2017 i journalen ACS Central Science , teamet beskrev en måde at ændre farvestrukturens bundring på.

"Det centrale er, at det hele er modulært og rationelt, "Siger Lavis. Vælg de rigtige atomer, forklarer han, og kemikere kan konstruere farvestoffer med næsten enhver ejendom, de ønsker.

Hans gruppe podede forskellige kemikalier på rhodaminer, og analyserede derefter de nye farvestoffers egenskaber. "Ingen havde nogensinde set på rhodaminer på denne systematiske måde før, "siger hovedmedforfatter Jonathan Grimm, en seniorforsker ved Janelia.

Farvestofferne syntetiseres i et enkelt trin med billige ingredienser, Siger Lavis. Det gør farvestofferne billigere end kommercielle alternativer - øre pr. Hætteglas. De lave omkostninger har gjort det muligt for hans team at dele deres arbejde med forskere rundt om i verden. Lavis, Grimm, og kolleger har nu sendt tusindvis af hætteglas til hundredvis af forskellige laboratorier.

"Disse farvestoffer er en komplet game-changer, "siger Ethan Garner, en bakteriecellebiolog ved Harvard University, der har brugt dem til at spore enkeltmolekylernes vej i sit laboratorium. Den ene ulempe havde været, at forskere ikke havde mange forskellige farver at vælge imellem. Men nu, han siger, med Lavis 'arbejde, "De kan faktisk dække hele spektralområdet."