Forskere udvikler en metode til at teste fluorescerende biosensorer, før de syntetiseres

Rice University-forskere har effektivt slukket en debat om mekanismen bag en fluorescerende biosensor, der overvåger neuroner ved at registrere ændringer i spænding.

Arbejdet ledet af Rice teoretiske kemiker Peter Rossky og postdoc-forsker Lena Simine bekræftede gennem computersimuleringer deres teori om, at en mekanisk proces kontrollerer slukning af fluorescens i ArcLight, en syntetisk spændingsindikator placeret i proteiner, der beklæder de indre membraner af neuroner.

Gennem deres modeller, forskerne koblede både mekanismen og fluorescensen til styrken af ​​elektriske felter, de observerede på tværs af kromoforen, den fluorescerende del af proteinet. Deres resultater viste, at et simpelt mål for feltet i en simulering kunne bruges til at forudsige, om og hvor godt nye fluorescerende sensorer vil opføre sig, før forskere syntetiserer dem, sagde Rossky.

Undersøgelsen fremgår af Journal of the American Chemical Society .

ArcLight, udviklet af Yale neuroforsker Vincent Pieribone i 2012, er et genetisk kodet fluorescensspændingsindikatorprotein. Den indeholder en mutation, der gør, at fluorescenssignalet dæmpes, når spændingen stiger, og lysner, når spændingen falder. Det gør det nyttigt til at spore signaler i nervesystemet ved at udtrykke proteinet i neuroner og se, hvordan de lyser op.

Proteinet er bundet til neuronens cellevæg af en spændingsfølende komponent, der bevæger sig nogle få ångstrøm, når et signal fra en anden neuron ændrer den elektriske ladning i membranen. Rice-forskerne teoretiserede, at bevægelse trækker proteinet mod membranen, komprimere det og slukke fluorescens.

Rossky sagde, at ændring af proteinets form bringer to rester en nanometer tættere på hinanden. Det er nok til at diktere, hvordan kromoforen slipper af med energi, enten som lys (ved at opgive fotoner og fluorescere) eller som varme.

"Vi antog, hvilken geometriændring der sker i proteinet som et resultat af membranens respons, " sagde Rosssky. "Og så spurgte vi, "Ændrer dette fluorescensen?" Og det fandt vi ud af, at det gør. Ud over, vi viste, at overvågning af en meget enklere kvalitet - det elektriske felt langs to akser, hvor fluorescensen kommer fra - er tilstrækkelig til fuldstændigt at beskrive responsen."

ArcLight viste sig at være en god model. Pieribone, en Rice-samarbejdspartner, fortalte deltagerne ved et foredrag i Rice i 2014, at selv han ikke vidste præcis, hvordan det fungerede. Foredraget inspirerede Simine, som lige var kommet til Rice, at gå i gang med en undersøgelse af mekanismen.

"Jeg troede, 'Det lyder som et godt projekt for mig, '" hun sagde.

Arbejdet med forskere i gruppen af ​​José Onuchic ved Rice's Center for Teoretisk Biologisk Fysik (CTBP) gjorde det muligt for Simine, en kemisk fysiker af uddannelse, at udnytte centrets ekspertise i at simulere proteiner til test.

Hun sagde, at en årti lang debat mellem forskere ikke formåede at afgøre, om proteiners mekaniske eller elektriske egenskaber forårsagede deres fluorescens. Det viste sig at være lidt af begge dele.

"Et nyligt papir gav beregningsbeviser for, at det overvejende er elektrostatisk, og det giver lidt mening, fordi proteinet er meget blødt, " sagde Simine. "Vi regnede også med, at de mutationer klæber til membranen, og når de gør det, proteinets orientering tillader proteinet at blive komprimeret." Hun fandt ud af, at elektrostatiske ændringer i neuronmembranen udløste den fysiske ændring, der slukker fluorescens, men efterlod også et elektrisk spor i proteinet, som kunne observeres i simuleringen.

"Vi tænkte lidt over det og fandt på en reaktionskoordinat, " sagde hun. "Vi kan tage enhver mutation af sekvensen af ​​dette protein og oversætte det til to tal, der er input for denne model, de elektrostatiske felter omkring kromoforen. Det er en dejlig, elegant fænomenologisk teori."

Laboratoriet planlægger at teste sin teknik på specialsyntetiserede fluorescerende proteiner og matchende simuleringer for at se, om deres teori og eksperimenter fortsat stemmer overens. Hvis de gør, de forventer, at deres modeller vil være yderst nyttige for syntetiske biologer, der laver nye klasser af fluorescerende markører.

"Hvis du vil vide fluorescensen fra et givet molekyle, du laver eksperimentet, " sagde Rosssky. "Men hvis du vil vide, hvorfor det virker, disse beregninger er utroligt værdifulde."