Frysrammemikroskopi indfanger molekyler, der låses og belastes af DNA

Skubber grænserne for kryo-elektronmikroskopi, University of California, Berkeley, forskere har fanget fryserammer af den ændrede form af et stort molekyle, en af ​​kroppens vigtigste molekylære maskiner, da den låser sig på DNA og indlæser maskineriet til læsning af den genetiske kode.

Molekylet, kaldet transkriptionsfaktor IID, er afgørende for at transskribere gener til RNA, der senere vil blive brugt som blueprints til fremstilling af proteiner. På grund af dens mange bevægelige dele og store størrelse, imidlertid, TFIIDs 3D-struktur har været svær at fange:de bevægelige dele bliver en sløring.

Cryo-EM, en billeddannelsesteknik, hvis opdagere fik Nobelprisen i kemi 2017, er den eneste måde at få et øjebliksbillede af omfangsrige, diskette strukturer som denne. Strukturoplysninger i høj opløsning er afgørende for at forstå, hvordan TFIID oversætter betjeningsvejledningen i vores genom, og hvordan det nogle gange går i stykker.

Den nye, mere detaljerede øjebliksbilleder af molekylets bevægelige dele kan hjælpe lægemiddeldesignere med at skabe lægemidler, der forstyrrer molekylets strukturelle ændringer for at justere ekspressionen af ​​et gen, der forårsager sygdom.

"Disse strukturer giver dig potentialet til rationelt at designe små molekyler, der vil forstyrre den normale funktion, for nu har vi ikke bare en enkelt struktur, vi har mange strukturer, hvilket er endnu mere kraftfuldt, fordi vi kan målrette mod den bevægelse, vi ser lige nu, "sagde Eva Nogales, en UC Berkeley professor i molekylær og cellebiologi og en fakultetsforsker ved Lawrence Berkeley National Laboratory.

Nogales og hendes kolleger, mest fremtrædende UC Berkeley kandidatstuderende Avinash Patel og Robert Louder, offentliggjorde deres fund online i denne uge forud for trykt offentliggørelse i tidsskriftet Videnskab .

"Hvor du klæber det stof, og hvordan du får det til at fungere, er stærkt afhængigt af disse strukturers forbigående natur, og det er noget, vi først for nylig er blevet klar over, "sagde Robert Tjian, en UC Berkeley professor i molekylær og cellebiologi, der opdagede TFIID og har arbejdet på molekylet i store dele af sin karriere, selvom han ikke var medforfatter til det nye papir. "Fordi disse molekyler bevæger sig rundt og deres strukturer er så komplicerede, konventionel lægemiddelfund ville aldrig afsløre, hvad der foregår. Evas strukturer kommer til at ændre det. Dette har potentialet til at åbne universet af lægemidler, der kan slås til. "

Frysende molekyler

TFIID er en agglomeration af mere end et dusin forskellige proteiner, der huser på en promotor - en region af DNA, der styrer transkriptionen af ​​et nærliggende gen - og tester sekvensen for at sikre, at den er landet på det rigtige sted. Når dette er bekræftet, det åbner for at rekruttere snesevis af andre proteiner, der derefter begynder at ratcheting langs genet, ved hjælp af DNA -sekvensen som en skabelon til at skabe en komplementær sekvens af RNA, kaldet messenger RNA. Dette vender sig derefter ud af kernen ind i cellens krop, hvor det oversættes af andre molekylære maskiner til protein.

"TFIID er nok den hårdeste struktur, nogen har forsøgt at løse, fordi den er massiv og meget fleksibel, "sagde Tjian." Den eneste måde, du kan se disse meget fleksible strukturer på, er ved cryo-EM, og Eva kan nu fryse alle disse forskellige fleksible tilstande og beskrive bevægelsen. "

Cryo-EM indebærer at fryse en dråbe indeholdende millioner af kopier af et molekyle, i enhver tænkelig retning, og ved hjælp af et elektronmikroskop til at bestemme strukturen ved at kombinere billeder til at definere 3D-formen. Fordi TFIID har mange bevægelige dele, da det binder sig til DNA og gør sig klar til at transskribere et gen, Gennemsnit af alle de frosne positioner giver et sløret billede.

Nogales sammenligner tidligere bestræbelser på billeddannelse af TFIID, herunder hendes egne forsøg, der går næsten 20 år tilbage, at tage et fotografi af et fodboldhold på banen og i gennemsnit beregne alle spillernes bevægelser. Resultatet er en generisk menneskelig torso med sløret hoved og lemmer.

Billeddannelse på fodboldbanen

Nu, takket være mere end to års intensivt arbejde af Patel og Louder, det er muligt at fange billeder med højere opløsning, der ligner at skelne et angribers benspark fra en målmands håndblok og en fuldbacks hovedstød.

"Forestil dig, at du har et billede af de 22 fodboldspillere på banen, og du skulle kombinere dem til en enkelt enhed, som du ville kalde 'den generiske fodboldspiller, "sagde hun." Det vil ligne et sløret billede - man kunne næsten ikke se, at det er en humanoid form, og at der er en slags bevægelse, men du ville ikke indse, at der er en forskel mellem spillerne. "

De forbedrede billeder er et resultat af bedre detektorer, der oprindeligt blev udviklet af kolleger på Berkeley Lab, and steadily improving computer algorithms to analyze the huge amounts of data collected by the detectors. This helped Nogales and her team to define five distinct structures of the TFIID molecule.

"They span the whole binding sequence:before binding to the DNA, initial binding to the promoter, subsequent binding after it double checks that this is the right place, and the final state, " Nogales said.

She and her colleagues continue to push the limits of cryo-EM, hoping to determine the 3-D structure of TFIID after other transcription proteins land on it to complete the transcription process.