Modellering af biomimetiske kollagen-ligand-interaktioner for at forstå intrafibrillær mineralisering

Levende organismer danner biologiske mineraler under biomineralisering, hvor uorganiske elementer selektivt kan deponere på specifikke organiske makromolekyler under præcis kontrol. Processen kan opdeles i biokalkning eller biosilicering baseret på den uorganiske komponent, med kollagen brugt som en universel skabelon. Under intrafibrillar mineralisering, kollagenmatricer, der er bestemt til mineralisering hos hvirveldyr, indeholder overfladebundne matrixproteiner. At forstå de komplekse mekanismer for intrafibrillær mineralisering til dannelse af hårdt kollagenholdigt væv, såsom knogler og dentin, er af betydelig interesse for biomekanik, med årtiers undersøgelser udført for at efterligne eller modellere processen i laboratoriet. I en nylig undersøgelse, nu udgivet i Videnskab fremskridt , Q. Sang og kolleger på de tværfaglige biologiske afdelinger, Anvendt fysik, Materialevidenskab og teknik, Biomedicinsk videnskab og tandlæge, i Kina, USA og Italien, har udviklet en biomekanisk model til undersøgelse af kollagen-ligand-interaktioner, der bidrager til intrafibrillær mineralisering.

I undersøgelsen, de brugte negativt ladet, højmolekylær polycarboxylsyre, tværbundet til rekonstitueret kollagen, at skabe den biomimetiske model. De udførte kryogen elektronmikroskopi og molekylær dynamiksimuleringer, for at vise, at kædelignende aggregater dannes efter krydsbinding til kollagen, langs den fibrillære overflade for at implementere fibrillær mineralisering. De observerede, at de negativt ladede, mineraliserede stilladser tillod dem at opnå højere kvalitet med bedre biomekaniske egenskaber, sammenlignet med mineralisering på umodificerede stilladser. Arbejdet med kollagen-ligand-interaktion gav forskerne indsigt i oprindelsen til heterogent mineraliserede væv og tydeliggjorde også de potentielle årsager til ektopisk forkalkning (upassende biomineralisering) i ikke-mineraliserede kropsvæv.

Biomineraler, der forekommer i naturen, indeholder i sig selv calcium for at danne calciumphosphat (CaP) og octacalciumphosphat som eksempler. CaP-holdige biomineraler udgør specifikt hvirvelhårdt bindevæv, der henviser til, at calciumcarbonat danner det invertebrale skelet. Kollagenfibriller kan bruges som mineraliseringsskabeloner på grund af nanoskala -kanaler i deres fibrillære strukturer til dannelse af nanoenginerede hybrider med kombineret styrke og modstandsdygtighed. Imidlertid, processen kan ikke opnås ved blot at nedsænke kollagenmatricer i en overmættet opløsning af mineralioner, i stedet kræver brug af nukleationshæmmere til stabilisering af ionforeningskomplekser og forhindring af deres krystallisering uden for fibrillerne. Som resultat, i det sidste årti, forskere har foreslået forskellige in vitro -modeller for at forstå mekanismerne for intrafibrillær mineralisering. I de foregående studiemodeller, hæmmere af krystalkernen blev inkluderet i mineraliseringsmediet og ikke bundet til kollagenfibrillerne, afviger fra det typiske scenario, der fandt sted i biologiske systemer. I den foreliggende undersøgelsesmodel, Song et al. tillod derfor inhibitorerne at binde kollagenfibrillerne for tilstrækkelig biomimik.

Da fysiologiske ikke -kollagene proteiner er vanskelige at ekstrahere og funktionelt komplekse til brug i biomimetiske mineraliseringsundersøgelser, Song et al. brugte anioniske polyelektrolytter som nukleationshæmmere i deres model for intrafibrillær mineralisering. Anioniske polyelektrolytter kan efterligne den meget anioniske og iboende forstyrrede proteinkonformation, der findes i ikke -kollagene proteiner. I den foreslåede model, polyelektrolyt-nukleationshæmmere bundet til matrixproteinfrit rekonstitueret kollagen som modeller for intrafibrillær mineralisering. Song et al. simulerede først molekylær dynamik for at vise, at en polyelektrolyt, såsom polyacrylsyre (PAA), kunne reservere calcium- og hydrogenphosphationkomplekser til kædelignende aggregater langs overfladen af ​​makromolekylet ved introduktion i et overmættet CaP-mineraliseringsmedium.

Baseret på den simulerede molekylære dynamik, Song et al. udviklet en testhypotese om, at en kernehæmmer, der er bundet til overfladen af ​​kollagenfibriller, kunne stabilisere CaP -mineraliseringsforstadier nær fibrillerne, for effektiv intrafibrillar mineralisering. For at teste hypotesen, de brugte kontroller med en ubundet version af den samme polyelektrolyt, der blev brugt til at stabilisere de CaP -forstadier, der indgår i mineraliseringsmediet i stedet.

Forskerne brugte højmolekylær polyacrylsyre - PAA (HPAA) til at simulere osteopontin og lavmolekylær PAA (LPAA) til at simulere osteocalcin. De tværbinder de polyanioniske elektrolytter kemisk for at rekonstituere kollagenfibriller eller svampe af type I ved hjælp af organiske forbindelser og undersøgte polymerkonstitutionen ved hjælp af Fourier transform infrarød spektroskopi (FTIR). Song et al. brugte transmissionselektronmikroskopi (TEM) til at observere PAA-bundne kollagenfibriller, der blev farvet røde og registrerede dem som elektrontætte filamentagtige aggregater på fibriloverfladen. De brugte derefter højeffektiv væskekromatografi til at undersøge egenskaberne ved binding/frigivelse af PAA-kollagensvampe.

Simulering af biomineraliseringens molekylære dynamik

For at forstå de forskellige faser af intrafibrillær mineralisering af HPAA-bundet kollagen (HPAA-kollagen), forskerne lavede film ved hjælp af elektrontomografidata fra de forskellige faser af biomineralisering. De simulerede (1) den tidlige fase - for at vise akkumulering af prenukleationsklynge -aggregater omkring det ikke -mineraliserede kollagenfibril, (2) midtfase - for at vise delvis intrafibrillær mineralisering og (3) sen fase - for at vise kraftig intrafibrillær mineralisering af HPAA -kollagenfibrillerne. De viste, at LPAA-kollagen ikke fremkaldte intrafibrillar mineralisering sammenlignet med HPAA i undersøgelsen, og inkluderede derfor ikke polymererne i de efterfølgende forsøg.

Song et al. brugte derefter molekylær dynamiksimuleringer af mineraliseringsprocessen til at forstå struktur-til-funktion-forholdet og validerede evnen af ​​kollagenbundet HPAA til at aggregere CaP-mineraliseringsforstadier. For det, de brugte en fuld atomistisk model af det hydratiserede HPAA-collagenfibrilkompleks. I enhedsmodellen, de simulerede Ca ²⁺ og HPO ₄ ^2- ioner og samlede CaP-mineraliseringsforstadier til dannelse omkring det kollagenbundne HPAA. Arbejdet afslørede fordelingen af ​​natriumioner, chlorid, calcium og HPO ₄ ^2- ioner langs aksen af ​​enhedsmodelgrænsen.

Undersøgelse af ultrastrukturen

Til ultrastrukturelle undersøgelser af den biomimetiske model, Song et al. brugte nanoindentation til at vurdere Youngs moduler af mineraliserede og ikke -mineraliserede kollagenfibriller med atomkraftmikroskopi (AFM). Værdierne lignede dem, der tidligere blev rapporteret for mineraliserede og ikke -mineraliserede fibriller, beregnet ved hjælp af nanoindentation. Forskerne brugte røntgendiffraktionsspektroskopi til at identificere tilstedeværelsen af ​​apatit på de mineraliserede svampe. Undersøgelsen viste, at HPAA-kollagen mineraliseret i CaP-opløsning i syv dage havde et højere mineralindhold end bare kollagen. Når Song et al. beregnet apatit/kollagenforholdet i de spektroskopiske profiler, HPAA-kollagensvampene indikerede højere mineraliseringsniveauer.

Modulet af sejhed, som typisk angiver den energi pr. volumenhed, som et materiale kan absorbere, før det brister, var også signifikant højere for HPAA-kollagensvampe, hvilket indikerer materialets brudresistens. Sådanne funktioner tegner sig for den høje modstandsdygtighed af biomineraliserede kollagenbaserede væv, der efterligner knoglemikroarkitektur for at kombinere knogleegenskaberne ved sejhed og styrke i regenerativ teknik. Song et al. krediterede de observerede egenskaber ved kohesiv/vedhæftning til HPAA -tværbinding, som gjorde det muligt at skabe kollagen/mineralkomposit, ligner det tværbundne osteopontin, der findes i knoglearkitektur.

Anvendelser af de nye biokompatible konstruktioner

Da biokompatibilitet af nye materialer er et vigtigt element i materialevidenskab og bioingeniør, Song et al. verificerede gunstige celle-materiale-interaktioner på HPAA-tværbundet kollagen ved hjælp af stamcelles levedygtighed og proliferation under in-lab knogleregenerering cellekultur. Når forskerne gennemførte mitokondrielle dehydrogenase- og apoptose -assays på humane mesenkymale stamceller, de observerede ikke signifikante forskelle mellem det unmineraliserede HPAA-kollagen og bare kollagensvampe. På grund af deres kompatibilitet med humane osteoblastlignende celler, sådanne materialer kan bruges som biokompatible belægninger til kirurgiske implantater.

På denne måde, Song et al. demonstreret en biomekanisk model for forbedring af intrafibrillar mineralisering ved hjælp af kollagen-ligand-interaktioner for at forstå de stedsspecifikke mekanismer. Denne model for kollagen-ligand-interaktioner kan også kaste lys over de potentielle årsager til ektopisk mineralisering, som er af interesse i øjeblikket. I perspektivet af Song et al., intrafibrillar mineralisering via kollagen-ligand-interaktioner kan infiltrere mineraler mere konsekvent i bulk-kollagenmatricer til anvendelser inden for regenerativ medicin. Resultaterne hjælper med at forstå de biomekaniske egenskaber, samtidig reducere fejl for at øge de biomimetiske egenskaber ved en mineraliseret kollagenmatrix i vævsteknik.

© 2019 Science X Network