Engineering ECM-lignende fibre med bioaktiv silke til 3-D cellekultur

Biologiske væv opbygges, når celler anker til bestemte steder på et 3-D mikrofibernetværk i en ekstracellulær matrix (ECM). Forskere er ivrige efter at genskabe biologiske væv i laboratoriet ved hjælp af bioinspireret vævsteknik og genteknologi, for at danne funktionelle ECM -motiver fusioneret til rekombinante silkeproteiner. Under passende fysiologiske forhold, bioingeniørfremstillede silkeproteiner og fibronectinsilke (FN-silke) kan selvsamles til mikrofibernetværk, der efterligner native ECM.

I en nylig undersøgelse, Ulrika Johansson, Mona Widhe og kolleger på de tværfaglige afdelinger inden for bioteknologi, Biomaterialer Kemi, og immunologi i Sverige udviklede en metode til at inkludere pattedyrsceller i en silkeopløsning, inden silke samles i konstruktioner, for at danne ensartede celleintegrerede vævslignende mikrofibre. De resulterende 3D-stilladskonstruktioner viste forbedret celleproliferation (vækst) og homogen cellespredning i forhold til celler indkapslet i hydrogel. Resultaterne af undersøgelsen er nu offentliggjort i Videnskabelige rapporter .

Forskerne bekræftede celleadhæsion på fibronectin-silkekonstruktioner (FN-Silk) i arbejdet ved at observere trådaktin og ved at definere fokale vedhæftningspunkter for den vedhæftede, aflange celler. De bevarede cellelevedygtighed i 90 dage i celle-FN/silkeoverfladerne og viste skalerbarhed af metoden til makro-størrelse 3-D cellekulturer. Silkemikrofiberbundterne med indkapslede celler opretholdt biomekanisk styrke og forlængelse meget ligesom menneskelige arterievægge.

Protokollen udviklet af Johansson og Widhe et al. tillod også stamceller at differentiere inde i 3D-konstruktionerne for at hjælpe væksten af ​​forskellige cellekulturer. De viste, at endotelceller kunne inkluderes i de bioinspirerede materialer for at danne karlignende strukturer gennem vævskonstruktionerne. Forskerne forestiller sig at bruge det ECM-lignende netværk som et fundament for fremtidige bestræbelser på at konstruere funktionelle biologiske væv i laboratoriet.

In vitro pattedyrscellekultur er en uundværlig eksperimentel teknik inden for grundforskning og industrielle applikationer, selvom den eksisterende proces afhænger af 2-D hård plast eller glasoverflader for nemheds skyld-hvilket forringer det native biologiske respons. Da biologiske celler naturligt er vant til at modtage signaler fra 3D-miljøet, vævsingeniører har dannet nye eksperimentelle strategier ved hjælp af 3-D cellekulturer. De eksperimentelle betingelser opretholdt celleadhæsion, spredning og differentiering for at genskabe og opretholde cellemetabolisme og funktionalitet i laboratoriet.

Tidligere har Johansson og Widhe et al. havde udviklet en skalerbar proces til at konstruere det rekombinante edderkoppesilkeprotein kendt som 4RepCT til bioinspireret cellekultur i laboratoriet, som selvsamles til bionedbrydelige og biokompatible mikrofibre i vandige, fysiologiske buffere ved stuetemperatur. De funktionaliserede den nye konstruktion ved hjælp af et celleadhæsionsmotiv fra fibronectin (FN) for at danne FN-silkematerialet og fremme fast celleadhæsion. Selvom cellerne spredte sig langs de nye materialeoverflader, de blev alene på overfladen, ude af stand til at formere sig til konstruktionerne for tilstrækkeligt at efterligne vævslignende egenskaber in vitro. I det nuværende arbejde, forskerne udviklede derfor en ny metode, for effektivt at indlejre celler i silkematerialet under samlingen af ​​FN-silke til indkapslet og levedygtig 3-D cellekultur, der tilstrækkeligt efterlignede den ekstracellulære matrix in vitro.

Vævstekniske celleindlejrede silkekonstruktioner i laboratoriet

Under forsøgene, Johansson og Widhe et al., tilføjede først en dråbe dispergerede stamceller (mesenkymale musestamceller, MMSC) til FN-silkeproteinopløsningen før løsningsmontering. Efter inkubation, det nydannede netværk forblev stabilt i kulturmedier, og det indkapslede celleantal steg i konstruktionerne gennem hele kulturperioden. Efter tre dage, cellerne spredes over alle dimensioner af skummet, som forskerne observerede ved hjælp af differential interferens kontrast (DIC) mikroskopi.

De instruerede cellejusteringen til at danne et tilfældigt 3-D netværk af mikrofibre, der med succes efterlignede biologiske væv ved at danne et makroskopisk bundt af mikrofibre under tidslinjen for cellekultur, efterfulgt af celle til ECM ratio undersøgelse. Forskerne varierede ECM til cellesammensætning for at efterligne eller matche en række vævstyper, herunder celle sparsomme og højdensitetsvæv i leveren. Metoden er derfor også velegnet til 3-D cellekultur med små cellemængder.

Test af cellelevedygtighed på silkestilladserne - undersøgelser af cytokompatibilitet

Forskerne brugte vækstprofiler til at kortlægge de forskellige celletyper indlejret i både skum og fibre i silkesamlingen. De observerede et øget signal fra den metaboliske aktivitet for at repræsentere celleproliferation i 3D-silke stilladserne og med tiden viste de øget celletæthed i det inderste cellesilke stillads. Johansson et al. undersøgte celleproliferation ved hjælp af BrdU -farvning, hvor positive resultater viste dybere spredning og cellespredning i silkefibrene for at opretholde cellelevedygtighed efter 2 ugers indkapsling, og under langvarige cellekulturperioder, der strakte sig over en til tre måneder.

Sammenligning af cytokompatibilitet af silke vs. hydrogelbiomaterialer

Baseret på de opmuntrende foreløbige resultater, forskerne gennemførte parallelle eksperimenter for at sammenligne cellevækst i silke kontra cellevækst i hydrogel for at bestemme cytokompatibilitet af de to materialer. De valgte alginat til at repræsentere hydrogel under cellekultur og observerede forskelle mellem alginat vs silke, registrering af klar celleudvidelse i silke, mens celler i alginat forblev i en stabil metabolisk tilstand. Ved hjælp af konfokal mikroskopi, de undersøgte årsager til den observerede forskel i cellevækst på niveau med mikromiljøet. Resultaterne viste hurtig celleadhæsion (set med aflange celler) i silkekonstruktionerne, mens alginatkonstruktionerne trak sig sammen under cellekultur, som kan have stresset cellerne til at løsne sig.

Biomekaniske undersøgelser - karakterisering af de nye materialer

De bestemte, at materialets overfladestivhed var en afgørende komponent, der påvirkede celleskæbnen. For at bekræfte denne observation, Johansson et al. testet biomekanisk adfærd af silkekonstruktionerne for at sikre, at de tilstrækkeligt efterlignede naturligt væv. De udførte trækprøvning i en fysiologisk buffer for at opnå resultaterne, som beviste, at de mekaniske egenskaber af silkeholdige celler matchede bindevævs egenskaber, såsom arterielle vægge. Johansson et al. var i stand til at demonstrere høj forlængelighed af mikrofibrene for at indikere kraftovergang til og i hele cellerne, der er knyttet til det nye biomateriale - hvilket bekræfter tilstrækkelig celleadhæsion.

Biofunktionaliseringsundersøgelser - undersøgelse af overfladebiokompatibilitet in vitro

Efter at have etableret biomekanisk stabilitet, forskerne testede, om stamcellerne, der voksede på silkestilladserne, kunne differentiere (modnes) på det samme materiale. For det, de brugte pluripotente og multipotente humane embryonale stamceller i cellekulturassays, efterfulgt af kvantificering af genekspression af biologiske markører for cellevækst; FOXA2 (metaboliske gener), SOX17 (gener til embryonisk udvikling og bestemmelse af celleskæbne), CER1 (knoglemorfogenetiske proteinantagonister) og NANOG (embryonale stamcelleproliferation, pluripotens og fornyelse). I resultaterne, både SOX17 og CER1 viste robust opregulering, mens biomarkøren for pluripotens (NANOG) faldt på grund af cellemodenhed som følge af tabet af pluripotens.

Forskerne testede overfladebiofunktionalisering for forskellige celletyper, herunder menneskelige skeletmuskelsatellitceller (HSkMSC) og knoglemarvsafledte humane mesenkymale stamceller (hMSC). Efter celleudvidelse på konstruktionerne, forskerne kunne styre hMSC'ernes skæbne ind i enten adipogene eller osteogene cellelinier. Derudover efter to ugers cellekultur, Johansson et al. viste myogen differentiering af HSkMSC'erne til dannelse af fremtrædende aktinfilamenter, og udtrykke den muskelspecifikke markør desmin, for at verificere modning af myotube in vitro.

Engineering biologiske fartøjer i laboratoriet

Forskerne kombinerede derefter endotelceller i det 3D-vaskulære netværk for at danne bindevæv, der efterlignede iboende cellulær organisation af mikro-kar i laboratoriet. De fulgte den samme protokol ved hjælp af silkesamling med celleintegration og tilføjede en brøkdel af endotelceller til at konstruere bindevævet. Om to uger, de observerede cellerne samles og danner millimeter lange forgrenede spirer og karlignende strukturer med fremtrædende ringe af endotelceller i silkefibrene. Forskerne kunne øge størrelsen af ​​konstruktionerne i skala og bestemme tilpasningen og aggregeringen af ​​forskellige celletyper.

På denne måde, Johansson og Widhe et al. demonstreret en ny strategi og udviklet en protokol til at passe ind i funktionelle celler inden for 3-D-netværk, der efterlignede den fibrøse arkitektur i den native ekstracellulære matrix (ECM). For at formidle eksperimentet, de brugte selvsamlende rekombinante silkeproteiner og viste, at en række forskellige celler kunne indlejres i 3D-konstruktionerne. Opsætningen og protokollen er enkel og omkostningseffektiv, i modsætning til 3D-udskrivning er processen nøjsom og praktisk, uden dyre maskiner. Forskerne sigter mod at optimere og standardisere denne protokol for at udvikle biokompatibel, avancerede silkematerialer inden for vævsteknik. Det eksperimentelle arbejde vil have en bred vifte af anvendelser inden for materialevidenskab som miniature in vitro -modeller til lægemiddeludvikling og som større bioingeniørvævskonstruktioner i regenerativ medicin.

© 2019 Science X Network