Forskere udvikler ny interferometrisk enkelt-molekyle lokaliseringsmikroskopi

Forskellige billedbaserede estimering af central position (benævnt "tyngdepunktstilpasning") metoder, såsom 2-D Gauss-tilpasningsmetoder, er almindeligvis blevet brugt i enkelt-molekyle lokaliseringsmikroskopi (SMLM) for præcist at bestemme placeringen af ​​hver fluorofor. Alligevel er det stadig en udfordring at forbedre enkeltmolekylets laterale lokaliseringspræcision til molekylær skala ( <2 nm) til billeddannelse af nanostruktur med høj kapacitet.

I en undersøgelse offentliggjort online i Naturens metoder , Prof. Xu Tao og Prof. Ji Wei fra Institut for Biofysik ved Det Kinesiske Videnskabsakademi udviklede en ny interferometrisk enkeltmolekyle lokaliseringsmikroskopiproces med hurtigt moduleret struktureret belysning, kaldet Repetitive Optical Selective Exposure (ROSE).

ROSE bruger seks forskellige retnings- og faseinterferenskanter til at excitere de fluorescerende molekyler. Intensiteten af ​​de fluorescerende molekyler er tæt relateret til fasen af ​​interferenskanterne. Et fluorescensmolekyle er lokaliseret ved intensiteten af ​​multiple excitationsmønstre af en interferenskant, giver omkring to gange forbedring i lokaliseringspræcision. Denne teknik har skubbet opløsningen af ​​enkelt-molekyle lokaliseringsmikroskopi (SMLM) til mindre end 3 nm (~ 1 nm lokaliseringspræcision).

Forskerne designet først tre forskellige gittergitter af DNA-origami-strukturer med 5-, 10- og 20-nm punkt-til-punkt afstand for at verificere ROSE's ydeevne. Både konventionel tyngdepunktsfitting og ROSE kunne løse 20-nm-strukturen med det samme fotonbudget. ROSE kunne også klart løse 10-nm afstanden, som ikke kunne løses ved tyngdepunktspasning.

Forskerne viste, at ROSE kunne løse en 5-nm struktur ved en opløsning på ~3 nm over et stort synsfelt på 25 x 25 μm ² , hvilket betyder, at ROSE har evnen til at skubbe opløsningskraften til SMLM til den molekylære skala.

Ud over, bruge ROSE til at analysere cellulære nanostrukturer, forskerne viste, at ROSE har fordele ved at løse den hule struktur af enkelte mikrotubuli filamenter, små clathrin-coated pits (CCP'er) og cellulære nanostrukturer af actin filament. Fourier-ringkorrelationsanalysen (FRC) viste, at ROSE forbedrede den endelige opløsning med det dobbelte sammenlignet med centroidtilpasningsmetoden.

ROSE kan udvides til 3-D nanometer-skala billeddannelse ved at indføre yderligere excitationsmønstre langs den aksiale retning. Forskerne forestiller sig, at denne metode kan udvide anvendelsen af ​​SMLM i biomakromolekyle dynamisk analyse og strukturelle undersøgelser på molekylær skala.