Styrker lægemiddelopdagelsen ved at evaluere antivirale midler i tusindvis af enkeltceller

En ny forbedring af en laboratorie-på-en-chip-enhed giver forskere mulighed for samtidig at observere tusindvis af individuelle celler, der er inficeret med virus, at give vigtig information om infektionsdynamik, der ikke er tilgængelig ved brug af traditionelle metoder.

Et team af forskere fra Penn State og University of Texas i Austin har forbedret en ældre version af en mikrofluidisk enhed, de udviklede, i høj grad at øge antallet af individuelle celler, der kan observeres på én gang, og gøre denne historisk besværlige enkeltcelletilgang levedygtig til lægemiddelscreening. Et papir, der beskriver enheden, som også giver indsigt i, hvordan de antivirale midler virker, og om en virus sandsynligvis vil udvikle resistens, vises online den 30. oktober, 2019 i bladet Videnskabens fremskridt .

"Traditionelle metoder til at studere effekten af ​​et antiviralt middel på inficerede celler fokuserer på en population af mange inficerede celler, " sagde Craig Cameron, professor og indehaver af Eberly Family Chair in Biochemistry and Molecular Biology ved Penn State på tidspunktet for forskningen og seniorforfatter af papiret.

"Når du anvender et antiviralt middel i en bestemt dosis til en befolkning, du kan se, hvor mange inficerede celler der bliver dræbt, eller effektiviteten af ​​det antivirale middel. Men individuelle celler kan reagere forskelligt på et lægemiddel, som kan have vigtige konsekvenser for infektionsresultater og lægemiddelresistens. Vi har tidligere udviklet en måde at studere individuelle inficerede celler, og her tilpassede vi teknikken til at ti gange antallet af enkeltceller, vi kan studere på én gang."

Holdet bruger en mikrofluidisk enhed - en chip ætset med bittesmå kanaler - med omkring 5700 individuelle brønde, som hver kan fyldes med enkelt, inficerede celler. Deres første generation af enheden var afhængig af en metode, der efterlod de fleste brønde tomme. Nu, holdet har udviklet en fysisk fælde, som de har inkorporeret i et af lagene på enheden, forbedre belægningen, så de nu kan fylde omkring 90 procent af brøndene.

"Andre mennesker har forsøgt at studere infektioner i enkeltceller, men de skal manuelt tilføje celler til 96-brønds eller 384-brønds plader, " sagde Wu Liu, en postdoc-forsker ved Penn State på tidspunktet for forskningen, som udviklede fælden. "Dette er kedeligt og tidskrævende. Med vores fælde og mikrofluidisk enhed, vi kan observere mere end 5000 enkeltceller på én gang."

For at teste den opdaterede enhed, holdet inficerede celler med en modificeret version af poliovirus, der producerer et grønt-fluorescerende protein og overvågede mængden af ​​fluorescens, som øges efterhånden som en virus replikerer i en celle, over tid. De anvendte også en af ​​tre antivirale forbindelser til inficerede celler. Disse forbindelser er kendt for at være effektive til behandling af virusinfektioner og virker via forskellige mekanismer, målrette mod forskellige dele af virussen eller værten for at forhindre virusreplikation.

Forskerholdet målte fem parametre for at beskrive infektionsforløbet - inklusive hvornår virussen begyndte at replikere, hvor hurtigt det replikerede, og den maksimale mængde af virusvækst - som tilsammen giver en signatur af den antivirale forbindelses virkning. Hver af de tre forbindelser havde en anden signatur, hvilket understøtter ideen om, at forbindelser med forskellige signaturer kan fungere på forskellige måder. Sammenligning af en forbindelses signatur med kendte lægemidler kan hjælpe med at indsnævre lægemidlets mål - information, der kræver betydelig opfølgningsforskning efter en befolkningsbaseret undersøgelse.

"Under udvikling af lægemidler, vi kan skabe en række forskellige forbindelser, der strukturelt ligner en lovende antiviral lægemiddelkandidat, " sagde Cameron. "Nu, ved at sammenligne signaturer, vi kan afgøre, om disse analoger virker på de samme mål og sammenligne dem med lægemidler, der vides at være sikre."

Ved at bruge enheden, forskerne kan også fortælle, om bestemte medlemmer af en viruspopulation er modtagelige for behandling, og i hvilket stadium af virussens livscyklus behandlingen virker. For eksempel, en klasse af lægemidler ser ud til at være rettet mod de stærkeste medlemmer af viruspopulationen, hvilket reducerer sandsynligheden for, at virussen udvikler resistens over for en behandling.

"Denne enkeltcellede tilgang kunne også være nyttig til at studere kombinationer af antivirale midler, da vi nu kan se andre effekter end blot den samlede mængde af drab, " sagde Cameron. "F.eks. en kombination af lægemidler kan bremse virusreplikationshastigheden, hvilket kan give værtens immunsystem tid til at fjerne infektionen. Det ville man ikke se ud fra en befolkningsanalyse."

Fordi de hurtigt kan give så meget information, teamet håber, at encellet tilgang vil supplere, eller måske endda erstatte, tidlige screeninger for lægemiddelkandidater. Fremgangsmåden kan også bruges til at screene lægemidler for enhver sygdom, for hvilken der findes et cellebaseret assay, der overvåger en ændring i fluorescens.

"Enheden er i øjeblikket udfordrende at fremstille, " sagde Cameron, "så vi arbejder på at gøre det mere tilgængeligt, så det kan bruges af alle."