Hudkræft mysterium afsløret i yin og yang protein

Det starter i det små, bare en plet på huden. De mest almindelige modermærker forbliver på den måde - harmløse klynger af hudceller kaldet melanocytter, som giver os pigment. I sjældne tilfælde, hvad der begynder som en muldvarp kan blive til melanom, den mest alvorlige type hudkræft hos mennesker, fordi den kan spredes i hele kroppen.

Forskere bruger kraftige supercomputere til at afdække mekanismen, der aktiverer cellemutationer, der findes i omkring 50 procent af melanomer. Forskerne siger, at de håber, at deres undersøgelse kan bidrage til en bedre forståelse af hudkræft og til design af bedre lægemidler.

I 2002 Forskere fandt en sammenhæng mellem hudkræft og mutationer af B-Raf (hurtigt accelereret fibrosarkom) kinase, et protein, der er en del af signalkæden, der starter uden for cellen og går ind for at dirigere cellevækst. Denne signalvej, kaldet Ras/Raf/Mek/Erk kinase-vejen, er vigtig for kræftforskning, som søger at forstå væk fra kontrol cellevækst. Ifølge undersøgelsen omkring 50 procent af melanomer har en specifik enkelt mutation på B-Raf, kendt som valin 600-resten til glutamat (V600E).

B-Raf V600E blev således et vigtigt lægemiddelmål, og specifikke inhibitorer af mutanten blev udviklet i de følgende år. Lægemidlerne hæmmede mutanten, men der skete noget mærkeligt. Paradoksalt nok, at stille mutanten havde en ulempe. Det aktiverede den ikke-muterede, vildtype B-Raf proteinkinaser, som igen udløste melanom.

"Med denne baggrund, vi arbejdede på at studere strukturen af ​​dette vigtige protein, B-Raf, " sagde Yasushi Kondo, en postdoc-forsker i John Kuriyan Lab ved UC Berkeley. Kondo er medforfatter til en undersøgelse fra oktober 2019 i tidsskriftet Videnskab der bestemte strukturen af ​​komplekset af proteiner, der udgør B-Raf og også fandt, hvordan den paradoksale B-Raf-aktivering sker.

"Vi havde til formål at studere den mere native-lignende tilstand af proteinet for at forstå, hvordan det reguleres i cellerne, fordi de fleste af undersøgelserne har været fokuseret på det isolerede kinasedomæne, og hvordan stofferne binder til kinasedomænet." sagde Kondo.

B-Raf-proteinet i fuld længde er lavet af flere domæner forbundet af uordnede områder, noget for uhåndterligt for forskerne endnu at forestille sig. Kondos teknik var at bruge inteinkemi til at lave mindre fragmenter, sy dem derefter for at få den fulde struktur.

"Som resultat, vi opnåede en aktiv form af fuldlængde B-Raf dimer kaldet B-Raf co-oprenset med 14-3-3 dimer, et stilladsprotein bundet til den phosphorylerede B-Raf C-terminale hale, " sagde Kondo.

Kondos gruppe brugte kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) til at bestemme strukturen af ​​B-Raf 14-3-3 kompleks, dybest set kryogen fryser proteinkomplekset, som holdt det i en kemisk aktiv, nær-naturligt miljø. Dernæst flashede de det med elektronstråler for at opnå tusindvis af 'fryse rammer'. De sigtede baggrundsstøj fra og rekonstruerede tredimensionelle tæthedskort, der viste hidtil ukendte detaljer i form af molekylet. Og for proteiner, form følger funktion.

Kondo forklarede, at strukturen afslørede en asymmetrisk organisering af komplekset, dannet af to sæt internt symmetriske dimerer, eller par af bundne molekyler. "Vi foreslår, at dette uventede arrangement muliggør asymmetrisk aktivering af B-Raf dimeren, som er en mekanisme, der giver en forklaring på oprindelsen til den paradoksale aktivering af B-Raf af små molekylehæmmere, " sagde Kondo.

Detaljeret analyse af den asymmetriske B-Raf 14-3-3 komplekse struktur viste et andet uventet strukturelt træk, beskrevet som det distale halesegment, DTS for kort, af et B-Raf-molekyle. Kondo sagde, at den ene hale er bundet til den andens aktive sted, blokerer dens aktivitet ved at konkurrere med ATP-binding. Det blokerede B-Raf-molekyle er stabiliseret i den aktive konformation. "Vi fortolkede denne struktur, at dette blokerede B-Raf-molekyle fungerer som en aktivator og stabiliserer den anden B-Raf-modtager gennem dimer-grænsefladen, " sagde Kondo.

Mærkeligt nok, forfatterne sammenligner B-Raf dimeren med det kinesiske yin-yang cirkulære symbol på indbyrdes forbundne modsætninger, der er forbundet ved halen. "Fra at se på emnet, det er meget tydeligt, at man ikke er i stand til at fosforylere nedstrømsmolekylet, som er nødvendig for cellevækst. Det andet molekyle er klart det, der skal gøre jobbet. I dette sæt af to molekyler, vi ser tydeligt, at en udfører det støttende arbejde, og den anden laver det egentlige arbejde. Det ligner virkelig Yin og Yang i dette B-Raf 14-3-3-kompleks, vi løste, " sagde Kondo.

Udseende, selvom, kan bedrage. Forskere brugte computersimuleringer til at hjælpe med at bekræfte, at de virkelig var inde på noget. "Vi kørte molekylær dynamik simuleringer af dette kompleks af B-Raf dimer bundet til en 14-3-3 dimer for at teste stabiliteten af ​​den asymmetriske konformation, " sagde studie medforfatter Deepti Karandur, også en postdoc-forsker ved John Kuriyan Lab ved UC Berkeley; hun er også postdoc ved Howard Hughes Medical Institute. "Vi vidste ikke, hvorfor konformationen var asymmetrisk, eller hvilken rolle det spillede for at opretholde enzymets aktive tilstand, " sagde Karandur.

De startede simuleringerne ved at bruge den struktur, som Kondo havde løst af cryo-EM, med DTS-segmentet, der løber fra den ene kinase til det aktive sted på den anden. Derefter kørte de et andet sæt simuleringer med DTS-segmentet fjernet.

"Det, vi fandt, var, at i systemet uden det distale halesegment, hele komplekset er ikke stabilt, " Karandur forklarede. "Kinasedomænerne bevæger sig i forhold til stilladset, 14-3-3 dimeren. I en af ​​vores simuleringer, den dimere tilstand af B-Raf selv, hvilke eksperimenter har vist er nødvendige for at opretholde den aktive tilstand af denne kinase, det faldt fra hinanden, angiver, at dette distale halesegment, DTS, er nødvendigt for faktisk at opretholde dette kompleks i denne asymmetriske konformation, hvilket igen er nødvendigt for at opretholde kinasedimeren i den stabile asymmetriske dimer aktive tilstand. "

Et af undersøgelsens hovedresultater var at finde virkningsmekanismen, der tænder B-Raf kinasekomplekset af to B-Raf kinaser og to 14-3-3 stilladsproteiner, hvor på B-Raf kinase er aktivatoren, og den anden er modtageren.

"Halen af ​​modtagermolekylet er inde i aktivatorens aktive sted, så aktivatoren kan ikke fungere som et enzym, " sagde Kondo. "I stedet, aktivatormolekylet stabiliserer den aktive konformation af modtagermolekylet. 14-3-3 stilladsproteinet letter dette arrangement, så haleindsættelsen kun sker for et kinasemolekyle. Vi antager, at når der ikke er nogen 14-3-3 binding, begge kinaser kan blokeres ved indsættelse af DTS, men dette skal testes."

Studiets beregningsmæssige udfordringer involverede simuleringer af molekylær dynamik, der modellerede proteinet på atomniveau, at bestemme kræfterne af hvert atom på hvert andet atom for et system på omkring 200, 000 atomer i tidstrin på to femtosekunder.

"For små systemer, vi kan se, hvad der sker relativt hurtigt, men for store systemer som disse, især store biomolekylære systemer, disse ændringer sker på lignende nanosekundstider, mikrosekund tidsskalaer, eller endda millisekunders tidsskalaer, "Sagde Karandur.

Karandur og kolleger henvendte sig til XSEDE, det NSF-finansierede Extreme Science and Engineering Discovery Environment, for tildelingstid på Stampede2 -supercomputeren på Texas Advanced Computing Center (TACC) til at udføre simuleringerne, samt Bridges-systemet ved Pittsburgh Supercomputer Center for at undersøge andre proteiner i pathwayen. Stampede2's Skylake processor noder, netværk med Intel Omnipath, lavet hurtigt arbejde med de optimerede til supercomputere NAMD molekylær dynamik-simuleringer.

"Stampede2 kører meget, meget hurtig, og det er meget effektivt. Vi genererede i alt omkring 1,5 mikrosekunders baner for vores systemer på omkring fire til seks uger. Der henviser til, hvis vi kørte det på vores egen interne klynge, ville det have taget os måneder eller længere, "Sagde Karandur.

Om XSEDE, Karandur kommenterede:"Jeg synes, det er en fantastisk ressource. Jeg har kørt simuleringer fra da jeg var kandidatstuderende. XSEDE gjorde det muligt for os at få adgang til tidsskalaer, der er biologisk relevante. Alt, hvad der sker i en celle, sker på mikrosekunders tidsskalaer, til millisekunders tidsskalaer, til længere. Da jeg startede, vi kunne ikke køre denne simulering på noget system nogen steder. Jeg mener, det ville have taget fem år, eller mere. For at kunne gøre det i uger og sige, okay, vi ved, hvorfor dette er vigtigt, så vi nu kan begynde at få en reel forståelse af, hvordan biologien sker, er bare fantastisk, " sagde Karandur.

Og der er stadig meget at finde ud af om B-Raf. Det er bare et led i signalkæden, der styrer cellevækst og kræft.

"Den struktur, der blev løst i dette papir, er en del af et stort, multi-domæne system, " Karandur forklarede. "Vi ved ikke, hvordan dette komplette protein ser ud. Vi ser det ikke i strukturen. Vi ved ikke, hvordan dens dynamik ser ud, og hvordan alle disse andre dele af proteinet spiller en rolle i opretholdelsen af ​​den aktive tilstand, eller konvertere den fra den inaktive tilstand til den aktive tilstand. "

Hun sagde videre, at efterhånden som systemet bliver større, de relevante strukturelle ændringer sker over længere tidsskalaer, og større supercomputere er nødvendige for at håndtere kompleksiteten, såsom den NSF-finansierede Frontera supercomputer, også hos TACC.

"Frontera når dertil. Vi er meget begejstrede for dette. Vi er i gang med at få en allokering på Frontera, " sagde Karandur.

For ikke-videnskabsmænd, denne grundlæggende forskning kunne give indsigt, der fører til bedre lægemidler mod hudkræft.

"Den paradoksale aktivering af Raf-kinase af disse B-Raf-specifikke inhibitorer omdanner normale celler til tumorer under behandling af hudkræft, " sagde Kondo. At forstå mekanismen bag dette fænomen vil give os mulighed for at designe bedre lægemidler. Forhåbentlig, vores undersøgelse kan bidrage til forståelsen af ​​dette trin. Ud over, vi fandt mutationer i denne forbindelse mellem Kinase-domænet og 14-3-3-bindingselementet i B-Raf-molekylet, som aldrig har været vist før. Denne mutation reducerer aktiviteten af ​​B-Raf i cellerne. Det indikerer også, at denne del af kinasedomænet kan være et mål for at udvikle nye slags B-Raf-hæmmere."

Sagde Karandur:"Der sker en masse dynamik i cellen. Vi er, hovedsagelig på grund af XSEDE, begynder først at kunne se sådan noget på. Fremadrettet, den eneste måde vi kan fortsætte med at se på tingene er ved at bruge meget, meget store supercomputere, fordi beregningerne kræver meget beregningseffekt. Det er virkelig spændende at kunne se disse ting ske og sige, her er, hvordan tingene ændrer sig på atomniveau; her er disse interaktioner mellem disse to atomer dannes eller brydes, og det udmønter sig i denne enorme ændring på globalt plan i proteinets overordnede struktur, og hvordan det interagerer med andre proteiner, eller andre molekyler i cellen. Vi er meget spændte på, hvor det vil gå i fremtiden. "

Studiet, "Cryo-EM struktur af et dimert B-Raf:14-3-3 kompleks afslører asymmetri i de aktive steder af B-Raf kinaser, " blev offentliggjort 4. okt. 2019 i bladet Videnskab .