Nye teknikker undersøger vitale og undvigende proteiner

Antallet af proteiner i menneskekroppen, samlet kendt som proteomet, er stort. Et eller andet sted mellem 80, 000 og 400, 000 proteiner cirkulerer i vores celler, væv og organer, udføre en bred vifte af opgaver, der er afgørende for livet. Når proteiner går galt, de er ansvarlige for et utal af alvorlige sygdomme.

Nu, forskere ved Biodesign Center for Applied Structural Discovery og ASU's School of Molecular Sciences, sammen med deres kolleger, undersøge en kritisk vigtig klasse af proteiner, som pryder de ydre membraner i celler. Sådanne membranproteiner fungerer ofte som receptorer for bindingsmolekyler, igangsætte signaler, der kan ændre celleadfærd på forskellige måder.

En ny tilgang til indsamling af strukturelle data for membranproteiner i overraskende detaljer er beskrevet i den nye undersøgelse. Kryogen elektronmikroskopi (eller cryo-EM) metoder, en banebrydende pakke værktøjer, anvendes. Yderligere, brug af såkaldt LCP-krystallisering og Microcrystal-elektrondiffraktion (MicroED) hjælper med at afsløre strukturelle detaljer om proteiner, der stort set har været utilgængelige gennem konventionelle metoder som røntgenkrystallografi.

Resultaterne beskriver den første brug af LCP-indlejrede mikrokrystaller til at afsløre proteinkonstruktion med høj opløsning ved hjælp af MicroED. Den nye forskning pryder forsiden af ​​det aktuelle nummer af Cell Press -tidsskriftet Struktur .

"LCP var en stor succes i membranproteinkrystallisering, ifølge Wei Liu, en tilsvarende forfatter til den nye undersøgelse. "Den nye omfattende anvendelse af LCP-MicroED giver løfte om forbedrede metoder til strukturel bestemmelse ud fra udfordrende proteinmål. Disse strukturelle tegninger kan bruges til at lette nyt terapeutisk lægemiddeldesign fra mere præcise indsigter."

En klasse af membranproteiner af særlig interesse er de G-proteinkoblede receptorer (GPCR'er), som danner den største og mest varierede gruppe af membranreceptorer, der findes i eukaryote organismer, herunder mennesker.

GPCR'ers fysiologiske aktiviteter er så vigtige, at de er et vigtigt mål for en lang række terapeutiske lægemidler. Det er dog her problemer opstår, som bestemmelse af den detaljerede struktur af membranproteiner - en væsentlig forløber for nøjagtigt lægemiddeldesign - udgør ofte enorme udfordringer.

Teknikken med røntgenkrystallografi er blevet brugt til at undersøge atomskala strukturer og endda dynamisk adfærd for mange proteiner. Her, krystalliserede prøver af det undersøgte protein rammes med en røntgenstråle, forårsager diffraktionsmønstre, som vises på en skærm. Ved at samle tusinder af diffraktions snapshots kan et 3D-strukturelt billede i høj opløsning samles ved hjælp af computere.

Alligevel mange membranproteiner, herunder GPCR'er, ikke danne store, velordnede krystaller passende til røntgenkrystallografi. Yderligere, sådanne proteiner er sarte og beskadiges let af røntgenstråling. At komme uden om problemet har krævet brug af specielle enheder kendt som røntgenfrie elektronlasere eller XFELS, som kan levere et strålende udbrud af røntgenlys, der varer kun femtosekunder, (et femtosekund er lig med en kvadrilliondel af et sekund eller omtrent den tid, det tager en lysstråle at krydse diamer af en virus). Teknikken til seriel femtosekund-røntgenkrystallografi gør det muligt for forskere at opnå et brydningsbillede, før den krystalliserede prøve ødelægges.

Alligevel, krystallisering af mange membranproteiner er stadig en ekstremt vanskelig og upræcis kunst, og kun en håndfuld af disse gigantiske XFEL -maskiner findes i verden.

Indtast kryogen elektronmikroskopi og MicroED. Denne banebrydende teknik involverer flashfrysning af proteinkrystaller i en tynd isfiner, derefter udsætte dem for en stråle af elektroner. Som i tilfælde af røntgenkrystallografi, metoden anvender diffraktionsmønstre, denne gang fra elektroner frem for røntgenstråler, at samle de sidste detaljerede strukturer.

MicroED udmærker sig ved at indsamle data fra krystaller, der er for små og uregelmæssige til at kunne bruges til konventionel røntgenkrystallografi. I den nye undersøgelse, forskere brugte to avancerede teknikker i tandem for at producere diffraktionsbilleder i høj opløsning af to vigtige modelproteiner:Proteinase K og A2A adenosinreceptoren, hvis funktioner omfatter modulering af neurotransmittere i hjernen, hjertekarudvidelse og T-celle immunrespons.

Proteinerne var indlejret i en særlig type krystal kendt som en lipidisk kubisk fase eller LCP -krystal, som efterligner det oprindelige miljø, sådanne proteiner naturligt forekommer i. LCP -prøverne blev derefter udsat for elektronmikroskopi, ved hjælp af MicroED -metoden, som muliggør billeddannelse af ekstremt tynde, krystaller i sub-mikron størrelse. Yderligere, kontinuerlig rotation af LCP -krystaller under elektronmikroskop gør det muligt at erhverve flere diffraktionsmønstre fra en enkelt krystal med et ekstremt lavt, skadesfri elektrondosis.

Evnen til at undersøge proteiner, der kun kan danne mikro- eller nanokrystaller, åbner døren for strukturel bestemmelse af mange meget vigtige membranproteiner, der har unddraget sig konventionelle undersøgelsesmidler, især GPCR'er.