Lysfølsomme E. coli-funktionelle biofilm som stilladser til hydroxyapatitmineralisering

Levende organismer har udviklet mekanismer for biomineralisering til at bygge strukturelt ordnede og miljømæssigt adaptive kompositmaterialer. Mens forskerhold har betydeligt forbedret biomimetisk mineraliseringsforskning i laboratoriet, det er stadig svært at konstruere mineraliserede kompositter med strukturelle egenskaber og levende komponenter meget som deres oprindelige modstykker. I en ny rapport nu offentliggjort den Naturens kemiske biologi , Yanyi Wang og et forskerhold i fysik, avancerede materialer, syntetisk biologi, og teknik i Kina, udviklet levende mønstrede og gradientkompositter inspireret af naturlige graderede materialer. De koblede lysinducerbar bakteriel biofilmdannelse med biomimetisk hydroxyapatit (HA) mineralisering i dette arbejde, for at vise, hvordan placeringen og graden af ​​mineralisering kunne kontrolleres. Cellerne i kompositterne forblev levedygtige, mens de registrerede og reagerede på miljøsignaler. Kompositterne viste en 15 gange stigning i Youngs modul (dvs. stivhed, forholdet mellem stress og belastning) efter mineralisering. Værket kaster lys for at udvikle levende kompositter med dynamisk lydhørhed og miljøtilpasningsevne.

Biomineralisering i laboratoriet

Levende organisme kan producere en række hierarkiske organisk-uorganiske sammensatte strukturer baseret på biomineralisering, hvor bemærkelsesværdige eksempler omfatter chitons radular tænder, fiskeskæl og krebsemandler, der opfylder forskellige biologiske funktioner. Tidspunktet og graden af ​​biomineralisering skal kontrolleres præcist af celler for at danne nøjagtige strukturer og funktioner i levende organismer. Nyere forskning inden for biomimetisk mineralisering havde fremhævet vigtigheden af ​​at udforske cellekontrollerede metoder til at producere levende mønstre og graderede kompositter som et lovende, men stort set uudforsket område. Disciplinerne syntetisk biologi og materialevidenskab har frigjort en række sofistikerede og miljøvenlige genkredsløb til bioingeniører en række nye cellulære funktioner. I dette arbejde, Wang et al. udviklet bioinspireret, levende kompositmaterialer ved at udnytte lysinducerbare Escherichia coli biofilm kombineret med biomimetisk mineralisering. Arbejdet åbner døre for at integrere konstruerede celler til fremstilling af mineraliserede materialer med strukturelle og levende egenskaber.

Teamet valgte fusionsproteiner til at konstruere mineralisering, der fremmer E. coli biofilm. Baseret på tidligere forsøg, de valgte protein Mefp5 - stammer fra Mytilus edulis, efterfulgt af Mfp3S-stammer fra Mytilus californianus og en anden variant af Mfp3S-peptidet (Mfsp3S-pep) for at starte mineralisering og fremme vedhæftning. Teamet konstruerede fusionsproteiner indeholdende et stort proteindomæne i E. coli biofilmen til dannelse af CsgA-Mfp fusionsproteiner og bekræftede deres potentielle sekretion fra manipulerede celler. De valgte derefter CsgA – Mfp3S-pep-fusionsproteinet som repræsentant for hydroxyapatitmineralisering og udførte eksperimenter for at verificere proteinets funktion for at fremhæve deres rolle under mineralisering og krystaldannelse. Derefter, Wang et al. konstrueret en lysinducerbar biofilmdannende stamme, der hed lys _modtager -CsgA-Mfp3S-pep, der kan reguleres tæt via blåt lys.

Den lysfølsomme stamme kunne generere funktionelle biofilm materialer efter belysning med lys for at fremme mineraliseringen af ​​hydroxyapatit (HA). For at validere dette, forskerne udsatte den lysfølsomme stamme for blåt lys i en petriskål og brugte histologisk farvning og transmissionselektronmikroskopi (TEM) til at vise produktionen af ​​amyloidfibre i biofilmene. Forholdsvis de observerede ikke amyloidfibre i prøver dyrket i mørket. Den konstruerede ekstracellulære matrix fungerede også som en skabelon for HA -mineralisering i tide, som de bekræftede efter 7-dages inkubation baseret på røntgendiffraktion (XRD) og energidispersiv røntgenspektroskopi (EDS) teknikker.

Baseret på den lysfølsomme karakter af de konstruerede biofilm, Wang et al. manipuleret biofilmdannelse i rumtid for at kontrollere dannelsen af ​​kompositter. De opnåede dette ved at belyse et bladmønster på flydende bakteriekulturer i polystyren petriskåle, der trofast recapitulerede det projicerede lysmønster på de bakterielle biofilm. Efter 7 dages mineralisering, kompositten genereret i petriskålene bevarede det originale mønster som observeret ved anvendelse af scanningselektronmikroskopi. Den lysregulerede tilgang kontrollerede komposittens form baseret på gittermønsterprojektioner og rumlig opløsning af lys i mikroskalaen-sammenlignelig med størrelsen af ​​de levende bakterier. Holdet bekræftede derefter levedygtigheden af ​​live, intakte celler ved at konstruere de levende kompositter til at udtrykke fluorescerende proteiner, som bekræftet ved hjælp af konfokalmikroskopibilleder. Derefter, de brugte termogravimetrisk analyse til at kvantificere de uorganiske komponenter i mineraliserede kompositter, hvor det uorganiske materiale steg proportionalt med tiden ved nedsænkning i simuleret kropsvæske (SBF). Wang et al. sammenlignede også Youngs modul for biofilmen ved hjælp af en mikroindrykningsteknik for at vise, hvordan mineralisering styrker E. coli biofilmene for at beskytte cellerne.

Tæthedskontrollerede gradientkompositter

Tissue engineering -tilgange har understreget behovet for præcist at identificere mellem hårdt og blødt væv for en vellykket fysiologisk ydeevne, derfor kunne lysintensiteten indstilles til at kontrollere tætheden og de mekaniske egenskaber ved konstruerede levende materialer. Zhang et al. opnået dette ved at udsætte E. coli -kulturer for forskellige lysintensiteter for at afsløre, hvordan biofilmtykkelsen faldt med den faldende intensitet af blåt lys. De viste yderligere, hvordan mineralisering blev stramt og lokalt styret af de konstruerede Mfsp3S-pep-fusionsproteiner. Derefter studerede de de lokale mekaniske egenskaber for belyste områder med mikroindrykning for at observere en firdobling i Youngs modul for at fremhæve levende kompositter konstrueret med afstembare mineralgradienter og mekaniske egenskaber til regenerative væv-til-knogle-grænseflader i knoglevævstekniske applikationer.

Implementering af levende kompositter til reparation af stedsspecifikke skader

Forskerne undersøgte også kapaciteten for de konstruerede biofilm til at aggregere for reparation af skader ved at lime polystyrenmikrosfærer, ved siden af ​​HA-mineralisering. Som bevis-på-koncept, de påførte levende mineraliserede kompositter til at fylde og reparere revner konstrueret på overfladen af ​​en polystyren petriskål. Under forsøgene, de lysinducerede klæbende biofilm fangede mikrosfærer i opløsning for at fylde den med vilje skabte beskadigede fure, mens nanofibre i biofilm fungerede som en skabelon for hydroxyapatitmineralisering for at konsolidere lysinduceret cementering under blålysbelysning. Brug af scanningselektronmikroskopi, Wang et al. viste, hvordan bakterier og den omgivende ekstracellulære matrix klæbte sammen med mikrosfærer for at illustrere de levende biofilmers klæbende funktion. De HA-mineraliserede kompositter dannede tætte, betonlignende lag, der lagde den beskadigede fure for at fremhæve mineraliseringsfunktionaliteten af ​​de levende kompositter for øget holdbarhed og reparationsapplikationer.

På denne måde, Yanyi Wang og kolleger producerede bioinspirerede levende mønstrede kompositmaterialer og levende graderede kompositter med en lysreguleret biofilmplatform. De resulterende kompositter viste miljøresponsivitet svarende til deres indfødte modparter. Cellerne i kompositterne forblev levedygtige og reagerede på miljøstimuleringer, selv efter mineralisering. Værket åbner en vej til at skabe liv, funktionelle organisk-uorganiske kompositter med adaptive og selvreparerende funktioner med anvendelser på tværs af biomedicin, regenerativ medicin, og bioremediering.

© 2020 Science X Network