Alsidige kemoproteomiske prober til aktivitetsbaseret proteinprofilering

Forskere bruger syntetiserede værktøjer til små molekyler, kendt som kemiske sonder, med lægemiddellignende egenskaber til at identificere specifikke typer af proteiner for at finde potentielle nye lægemiddel leads. Imidlertid, aktuelt tilgængelige teknologier er ikke i stand til at få adgang til terapeutiske mål, der har metaller, metabolitter, eller post-translationelle modifikationer.

Nu, en undersøgelse fra laboratoriet af Megan Matthews og kollegaer foreslår nye måder at manipulere denne klasse af sygdomsmål på, som indtil videre er forblevet "udugelig". Resultaterne blev offentliggjort i ACS Central Science og findes på publikationens septemberomslag.

Forskere i Matthews-laboratoriet er kemiske biologer, der er tværfaglige og samarbejdende. De har ekspertise inden for syntetisk kemi, enzymologi, cellebiologi, og massespektrometri-baseret kemisk proteomik, som almindeligvis bruges til at karakterisere små molekyle-protein-interaktioner og deres virkninger på proteinfunktionen. Ved hjælp af denne tilgang, forskerne kan globalt profilere og opdage proteiner, der reagerer med specifikke prober, forstå, hvad disse proteiner gør, og hæmmer proteinets aktiviteter ved hjælp af nye mekanismer.

I dette studie, forskerne fokuserede på at kortlægge den kemiske reaktivitet af en organohydrazin, –NHNH ₂ , sonde, der efterligner en af ​​de første FDA-godkendte antidepressiva, kendt som phenelzin, ved hjælp af en metode kaldet aktivitetsbaseret proteinprofilering (ABPP). Klassiske ABPP -prober er målrettet mod en enkelt type aminosyre, der er nukleofil, eller elektronrig, der henviser til, at hydrazinprober er designet til at fange enzymkofaktorer og post-translationelle modifikationer, der er elektrofile, eller elektronfattig.

"Hydraziner fanger alle mulige virkelig spændende mål med virkelig interessant kemi, så vi bruger det som et startpunkt for enzym-inhibitor opdagelse, " siger Matthews, denne undersøgelses hovedforsker. "Vi ønskede at spørge, hvad er alle de ting, som denne farmakofor kan gøre på hele proteomområdet, og på grund af massespektrometri kan vi gøre dette."

Efter at have installeret deres sonde i to humane cellelinjer, de viste, at proberne reagerer med mål fra flere enzymklasser, der bruger en række forskellige kofaktorer; cofaktorer er forskellige typer kemiske maskiner, der hjælper et protein med at udføre sin funktion. Derefter, ved at kortlægge stederne for probemærkning på proteinerne, forskerne demonstrerede to former for reaktivitet, kaldet direkte polært angreb og oxidativ aktivering/fragmentering, der er afhængige af hydrazins alsidige egenskaber og dets evne til at fange forskellige typer elektronmangel.

En af de største tekniske udfordringer, siger postdoc og første forfatter Zongtao "Tom" Lin, identificerede, hvor og hvordan sonden reagerede med proteinerne, fordi det ikke er noget, der var let at forudsige. "Vores løsning var at bruge isotopiske hydrazinsonder, udskiftning af naturlige mængder nitrogenatomer ¹⁴ N, med sin 'tunge' modstykke ¹⁵ N. Dette gjorde det muligt for os at se, om hydrazingruppen var tabt efter at have reageret med proteinet eller ej, " siger Lin. "Derefter, vi stolede på en beregningsmæssig arbejdsgang for at matche peptidfragmenteringsmønstrene og indsnævre stederne for sondemærkning. Denne kombination af isotopiske hydrazinsonder og beregningssøgninger tillod os at nå vores mål. "

Teamet fandt ud af, at selvom hydraziner er bredt reaktive, de forbliver rettet mod det aktive sted og blokeres af andre molekyler, der optager et proteins aktive sted. "Fordi de er rettet mod funktionel kemi, de er i stand til at udlæse den funktionelle tilstand af mange forskellige enzymklasser. Det er ret fantastisk, fordi det nærmer sig den hellige gral med enkelt sonde for at kunne profilere enhver proteinfunktionalitet, der er elektronmangel, " siger Matthews. "Så nu, i princippet, vi kan udvikle selektive molekyler for mål, der findes i denne ukendte halvdel af proteomet, som nu er 'medicinerbart', "og det er virkelig kraftfuldt og ekspansivt."

Næste, forskerne vil udarbejde og indstille disse hydraziner for at undersøge, om diversificerede nukleofiler har samme kapacitet som elektrofiler til at fungere som potente, selektive inhibitorer af cofaktorafhængige enzymer.

Matthews tilføjer, at fordi disse metoder er "sygdomsagnostiske, " der er unikke muligheder for at studere aktiviteter, der er dyregulerede i patientprøver og sygdomsmodeller. "Samlet set, vi forventer, at hydrazinsonder bevarer alle funktionerne fra klassiske ABPP-sonder, herunder opdagelse af hæmmere og nye virkningsmekanismer, " siger Matthews. "I nogle tilfælde, vi håber at afsløre noget ny biologi, også."