Hvad er funktionen af ​​en Tris-buffer i DNA-ekstraktion?

Tris, eller tris (hydroxymethyl) aminomethan, er en almindelig biologisk buffer, der anvendes i hele DNA-ekstraktionsprocessen. Under udvinding fra et hvilket som helst antal kilder er DNA pH-følsomt. Under cellelyse anvendes fjernelse af uønskede cellulære komponenter og udfældning, tris til at opretholde en stabil pH. Derudover spiller den en særlig vigtig rolle i cellelys.

TL; DR (for lang tid, ikke læst)

DNA-ekstraktion er en pH-følsom proces og ved anvendelse af en tris buffer hjælper med at holde pH stabil over cellysis og ekstraktion.

Tris som buffer

Da pH kan påvirke og påvirkes af en række cellulære faktorer, er det vigtigt at opretholde en stabil pH for eksperimentel videnskab . Biologiske buffere, som tris, er vigtige, fordi de kan opretholde en stabil pH på trods af påvirkninger, der ellers kunne ændre pH. Tris (hydroxymethyl) aminomethan med en pKa på 8,1 er en effektiv buffer mellem pH 7 og 9. På grund af dets neutrale område er tris en almindeligt anvendt buffer i biologiske laboratorier. Tris-bufferen er imidlertid temperaturfølsom og bør bruges til den temperatur, hvor den oprindeligt blev pH-værdi for at undgå unøjagtighed.

Lysis of Cells

Lysis, eller at åbne cellerne, er den første trin af DNA-ekstraktion. Dette opnås ved hjælp af en buffer indeholdende tris og EDTA (ethylendiamintetraeddikesyre). EDTA binder divalente kationer, såsom calcium og magnesium. Da disse ioner hjælper med at opretholde cellemembranens integritet destabiliserer membranen dem ved at eliminere dem med EDTA. Tris er den vigtigste bufferingskomponent; dens hovedrolle er at opretholde bufferens pH på et stabilt punkt, sædvanligvis 8,0. Derudover interagerer tris sandsynligvis med LPS (lipopolysaccharid) i membranen, der tjener til destabilisering af membranen yderligere.

Tris beskytter DNA'et mod pH-skift

Når cellerne brydes fra hinanden, bliver deres DNA og indholdet spildes i bufferen. Derudover er RNase A (ødelægger RNA), proteaser (ødelægger proteiner) og SDS (natriumdodecylsulfat, solubiliserer membranfragmenterne) ofte inkluderet. Tilsammen kan denne suppe af cellulært indhold og fragmenteret RNA og proteiner have stor indflydelse på opløsningens pH. Fordi DNA er pH-følsomt, er det vigtigt for tris at buffere suppen og holde pH-værdien stabilt.

DNA-præcipitation

I det sidste trin af DNA-ekstraktion er DNA'et selv ekstraheret fra opløsningen. På dette tidspunkt er DNA'et opløseligt i bufferen. For at ekstrahere fra opløsningen gøres DNA'et uopløseligt ved tilsætning af ethanol eller isopropanol (isopropylalkohol). Når dette er gjort, bliver DNA'et indlysende i opløsning som et hvidt stof. Selv om DNA kan isoleres fra de resterende cellulære komponenter på denne måde, er det ikke "brugbart", når det er uopløseligt. Efter isolering fjernes alkoholen, og DNA skal returneres til en biologisk buffer, som tris, der skal bruges.

Gør det selv

Selvom udvinding af DNA almindeligvis udføres i forskningslaboratorier generelt ved hjælp af en af ​​et antal kommercielt tilgængelige sæt, kan enhver gøre DNA-ekstraktion derhjemme ved brug af almindelige husholdningsartikler og grønne ærter eller spinat. I dette tilfælde er tris eller nogen biologisk buffer ikke til stede for at beskytte DNA'et mod pH-skift. Det er dog en vis måde at hjælpe eleverne til at forbinde med cellulært DNA.