Ved at kombinere CRAGE- og CRISPR-teknologier har forskerne en meget nemmere metode til at karakterisere sekundære metabolitter. Kredit:Cell Chemical Biology (2021). DOI:10.1016/j.chembiol.2021.08.009
Mikrobielle sekundære metabolitter, de molekyler, der ikke er essentielle for vækst, men alligevel essentielle for overlevelse, kan nu være nemmere at karakterisere efter et proof-of-concept-studie, hvor forskere parrede CRISPR- og CRAGE-teknologier.
Mens CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) er det førende værktøj til nøjagtig redigering af genomer, har dets effektivitet historisk været begrænset på grund af manglen på robuste værktøjer til rådighed til at transportere CRISPR ind i mikroorganismer. CRAGE (Chassis-uafhængig Recombinase-Assisted Genome Engineering) er en teknik, forskere kan bruge til at integrere store genetiske nyttelaster direkte i forskellige mikrober.
Kombinationen af CRAGE med CRISPR giver forskere en kraftfuld tilføjelse til deres værktøjssæt til at studere genfunktion. Som en demonstration brugte forskerne CRAGE-CRISPR til at opdage aktive sekundære metabolitter og hjælpe dem med at identificere og beskrive funktionerne af de biosyntetiske genklynger, der producerer dem.
Sekundære metabolitter er mikrobielle forbindelser produceret som reaktion på modgang eller konkurrence. De udgør grundlaget for en række vitale produkter inden for bioteknologi, medicin, landbrug og andre industrier - men der er stadig så meget om dem, vi ikke ved.
Det kan være kompliceret at låse op for kraften af sekundære metabolitter, fordi de BGC'er, der producerer dem, ikke kan aktiveres i laboratoriemiljøer. CRAGE gjorde nogle fremskridt med at overvinde denne forhindring, da den ramte scenen i 2019. Nu er den kraft klar til at vokse eksponentielt ved at kombinere den med CRISPR.
Ved at anvende CRAGE er forskere ikke længere begrænset til at bruge modelværtsmikrober; teoretisk set kan enhver mikrobe tjene som fabrikken til fremstilling af kemiske forbindelser af interesse. Ved at bruge CRAGE til at domesticere målmikrober kan JGI-brugere derefter anvende CRISPR i en række forskellige mikrobielle værter.
Photorhabdus luminescens viser sig dødelig for insekter. Det bæres af en infektiøs nematode og frigiver toksiner til insektets blodbane, der hurtigt dræber værten. At forstå præcis, hvordan P. luminescens og dets sekundære metabolitter virker, kunne give nye værktøjer til skadedyrsbekæmpelse.
Sekundære metabolitter er stærkt reguleret i bakterier, hvilket gør det vanskeligt at identificere, hvilken vej der svarer til hvilken metabolit. At finde et middel til at introducere CRISPR i mikroben er nøglen, fordi det giver forskere mulighed for at slette eller aktivere bestemte gener og vurdere, hvordan disse redigeringer påvirker funktionaliteten.
CRAGE muliggør transplantation af disse BGC'er fra én organisme til en alternativ vært via en landingspude, der består af et cre-rekombinasegen og gensidigt eksklusive lox-steder. I sidste ende gør denne proces det muligt for forskere at identificere stammer, der er i stand til at producere sekundære metabolitter i et laboratoriemiljø, og skinner et lys ind i dette "biologiske mørke stof."
Det giver også CRISPR et indgangspunkt. Ved at bruge CRISPR til at slå ud eller aktivere gener, var forskere ved JGI i stand til at overvåge tab- og gain-of-funktion. Undersøgelsens analytiske data viser toppe og dale i sekundære metabolitter, efterhånden som generne redigeres. Ved hjælp af CRAGE viste parringen sig hurtigt at bekræfte øget produktion af 22 metabolitter fra seks biosyntetiske genklynger. En af dem var en metabolit fra en tidligere ukarakteriseret biosyntetisk genklynge. Dette arbejde af JGI-forskere blev offentliggjort april 2022 i Cell Chemical Biology .
Når det kommer til insektdræberen P. luminescens specifikt, kan forståelse af dets sekundære metabolitter og deres veje give næring til yderligere landbrugsapplikationer til skadedyrsbekæmpelse og forståelse af, hvordan patogenet bruger insekter til brændstof.
Indvirkningen af parringen kan vise sig at være meget mere vidtrækkende. Kompatibiliteten af CRAGE og CRISPR kunne potentielt give mulighed for at introducere CRISPR i andre bakterier, og derved forbedre det videnskabelige samfunds forståelse af, hvordan sekundære metabolitter produceres, og hvordan de kan udnytte deres kræfter inden for landbrug, farmaceutiske produkter, biobrændstoffer og mere. + Udforsk yderligere