Forskere løfter sløret for en omfattende samling af rhodamin-baserede fluorescerende farvestoffer

Da seniorforsker Jonathan Grimm kom til Janelia for 13 år siden, vidste han ikke meget om fluorescens eller fluorescerende farvestoffer. Men som en organisk kemiker, der havde arbejdet med lægemiddelopdagelse hos Merck, vidste han bestemt en ting eller to om medicinsk kemi.

På et indfald besluttede Grimm og Janelia Seniorgruppeleder, Luke Lavis, at prøve at bruge en grundpille, medicinsk kemi-reaktion, som Grimm havde opfanget i den farmaceutiske industri for at forbedre århundredgamle farvestofkemi. De mente, at denne tilgang kunne give adgang til helt nye, tidligere utilgængelige rhodaminer – molekyler Lavis havde arbejdet på at gøre lysere og længerevarende, så de kunne bruges til bedre at afbilde celler under kraftige mikroskoper.

Resultatet var starten på, hvad der ville blive de nu allestedsnærværende og uundværlige Janelia Fluor-farvestoffer, lyse, fotostabile, cellegennemtrængelige fluorescerende sonder, der gør det muligt for biologer at se molekylerne inde i cellerne. Mere end et årti efter, at de først blev afsløret, er disse fluorescerende farvestoffer, der spænder over farvespektret, blevet en fast bestanddel af biologiske laboratorier verden over.

Ved at bruge en lignende tilgang har Grimm, Lavis og deres samarbejdspartnere nu frigivet kulminationen på deres års arbejde i Journal of the American Chemical Society :en omfattende samling af yderligere rhodamin-baserede fluorescerende farvestoffer - et helt nyt sæt af langt rødt forskudte farvestoffer, der kan trænge dybere ind i væv og er gode til in vivo-billeddannelse, hvilket gør dem meget vigtige for biologer.

Holdet delte også deres tilgang – den nye kemi, de udviklede for at syntetisere de farvestoffer og indsigter, der giver en køreplan for design af fremtidige sonder.

"Undervejs anvendte eller modificerede vi eller fandt på helt nye måder at lave rhodaminer på, som har et ret bredt anvendelsesområde, og som gjorde det muligt for os at lave så mange farvestoffer relativt hurtigt," siger Grimm. "Dette er nok det mest omfattende arbejde, vi hidtil har udført med rhodaminer."

Oprettelse af en omfattende samling

Det seneste projekt startede ved begyndelsen af ​​COVID-19-pandemien i begyndelsen af ​​2020. Holdet havde netop udgivet forskning, der beskriver den nye kemi, de brugte til at udvide Janelia Fluor-farvepaletten.

Dernæst ville de se, om de kunne anvende det, de lærte om at optimere Janelia Fluor-farvestofferne, på andre typer rhodamin-baserede farvestoffer, samtidig med at de yderligere forbedrede kemien, der blev brugt til at syntetisere dem.

Da verden lukkede ned, planlagde Grimm og Lavis ny kemi – inklusive helt nye kemiske reaktioner – der søgte at rationelt inkorporere erfaringerne fra Janelia Fluor-farvestofferne i andre klassiske, men suboptimale rhodaminer.

Et par måneder senere kom Grimm tilbage i laboratoriet og begyndte at se, om deres arbejde på papir kunne oversættes til den virkelige - og nogle gange uforudsigelige - verden af ​​organisk kemi. Med COVID-forholdsregler på plads arbejdede Grimm alene i laboratoriet, optimerede kemien og skabte de første nye farvestoffer.

"Det ville nok være sket alligevel, men på godt og ondt, når der ikke er andet at fokusere på, eller tingene at fokusere på var dårlige - som 2020 var for alle - var kemi en god distraktion," siger Grimm.

Den nye forskning udstikker kulminationen på teamets arbejde over de sidste tre år. I modsætning til de traditionelle Janelia Fluor-farvestoffer, som er karakteriseret ved et vedhæng kaldet en azetidinring, har de andre rhodamin-baserede farvestoffer forskellige substituenter, der stikker ud fra andre dele af deres molekylære strukturer.

Bevæbnet med viden fra optimering af JF-farvestofferne modificerede holdet disse andre områder på de ældre rhodaminfarvestoffer for at ændre deres farve, lysstyrke, fotostabilitet, cellepermeabilitet og andre egenskaber.

Resultatet er et helt nyt sæt rhodamin-baserede farvestoffer til billeddannelse. Holdet var også i stand til at udtænke flere nye måder at fremstille klassiske rhodaminfarvestoffer på, hvilket gør dem i stand til at skabe snesevis af funktionelle versioner relativt hurtigt.

"Vi havde længe vidst, hvordan ændring af funktionaliteten på 'toppen' af molekylet påvirker farverne på fluoroforerne, men vi fandt også ud af, at dette stærkt påvirker farvestoffets kemiske egenskaber," siger Lavis. "Vi udnyttede det på forskellige måder til at lave lyse, rødforskudte billedbehandlingsmidler."

Det sidste kapitel

Selvom dette ikke er slutningen på historien for rhodaminfarvestoffer, bevæger arbejdet sig sandsynligvis i en anden retning. Nu er teamet fokuseret på at designe reagenser, der er specielt skræddersyet til brug af deres biolog-samarbejdspartnere, og arbejder på at bygge de allerbedste værktøjer, de kan med den viden, de har opnået.

"Vi kan lave ethvert rhodaminfarvestof, vi nogensinde vil have med denne kemi, og så det store spørgsmål er, hvad vi laver næste gang," siger Lavis. "Det er ikke, hvad vi kan lave, men hvad skal vi lave."

Grimm siger, at udviklingen af ​​dette omfattende sæt rhodaminer, som tog over et årti, er et vidnesbyrd om HHMI Janelias støtte til langsigtede indsatser, der er gavnlige for det bredere videnskabelige samfund. At have fastansatte videnskabsmandsstillinger hos Janelia gør det også muligt for Grimm og andre seniorforskere at give kontinuitet til et stort projekt som Janelia Fluor-farvestofferne. Fire af forskerne på den mest aktuelle publikation var også på det allerførste rhodaminfarvepapir, som laboratoriet udgav i 2011.

For Grimm betyder det også, at han kan gøre det, han elsker – være i laboratoriet, lave kemi og skabe værktøjer, der er nyttige for biologer. Og mere end 13 år senere har han også lært en ting eller to om fluorescerende farvestoffer.

"Det er meget tilfredsstillende at have denne tidslinje af papirer, der viser alt, hvad vi har gjort gennem årene, og det hele startede med kun en tilfældig reaktion baseret på en lille beregning, som Luke gjorde, som i sig selv blev aktiveret af en syntetisk metode, der vi tilfældigvis forfulgte, på et indfald, simpelthen for at gøre farvesyntese lidt lettere," siger Grimm. "Selv om et regnestykke ser godt ud, lykkes det ikke altid på den måde. I dette tilfælde var det dødt, og det gav bestemt pote."

Flere oplysninger: Jonathan B. Grimm et al., Optimized Red-Absorbing Dyes for Imaging and Sensing, Journal of the American Chemical Society (2023). DOI:10.1021/jacs.3c05273

Journaloplysninger: Tidsskrift for American Chemical Society

Leveret af Howard Hughes Medical Institute