Protokol til nitratreduktase ved anvendelse af natriumnitrit som standard?

Protokol til nitratreduktaseassay ved anvendelse af natriumnitrit som standard

Denne protokol skitserer en almindelig metode til måling af nitratreduktaseaktivitet ved anvendelse af natriumnitrit som standard.

Materialer:

* plantemateriale: Friske blade, rødder eller andre væv indeholdende nitratreduktase.

* Ekstraktionsbuffer:

* 100 mm Tris-HCl-puffer, pH 7,5

* 1 mm EDTA

* 10 mm DTT (dithiothreitol)

* 0,1% (w/v) bovint serumalbumin (BSA)

* reaktionsblanding:

* 100 mm kaliumphosphatbuffer, pH 7,5

* 10 mM natriumnitrat

* 1 mm Nadh

* natriumnitrit standardopløsning: Forbered en standardopløsning af kendt koncentration (f.eks. 100 ppm).

* griess reagens: (Se specifikke protokolinstruktioner)

* spektrofotometer: Til måling af absorbans ved 540 nm.

* centrifuge: Til adskillelse af celleaffald.

* isbad: At opretholde kolde temperaturer.

* pipetter og tip: For nøjagtige volumenmålinger.

Procedure:

1. prøveforberedelse:

* Høst plantemateriale og skyl hurtigt med koldt destilleret vand.

* Vej en passende mængde væv (f.eks. 0,1-1 g), og slib det i en mørtel og en pistil med flydende nitrogen eller ved hjælp af en homogenisator i ekstraktionsbuffer.

* Centrifuger homogenatet ved 10.000 g i 10 minutter ved 4 ° C for at fjerne celleaffald. Supernatanten er dit enzymekstrakt.

2. nitratreduktaseassay:

* Forbered en række rør indeholdende reaktionsblandingen, inklusive emner uden enzymekstrakt, og rør med forskellige koncentrationer af natriumnitritstandard.

* Tilføj et passende volumen af ​​enzymekstrakt til reaktionsrørene.

* Start reaktionen ved at tilføje NADH.

* Inkuber rørene ved 30 ° C i en bestemt tid (f.eks. 30 minutter).

* Afslut reaktionen ved at tilsætte Griess -reagens.

3. Måling af nitritproduktion:

* Inkuber rørene i mørke i mindst 15 minutter for at give mulighed for farveudvikling.

* Mål absorbansen ved 540 nm ved hjælp af et spektrofotometer.

* Forbered en standardkurve ved hjælp af de kendte koncentrationer af natriumnitrit.

* Beregn mængden af ​​nitrit produceret af enzymekstrakten ved hjælp af standardkurven.

4. Beregning af nitratreduktaseaktivitet:

* Udtrykk nitratreduktaseaktivitet som µmol af nitrit produceret pr. Minut pr. Gram frisk vægt (FW) eller protein .

Bemærk:

* Denne protokol er en grundlæggende oversigt, og specifikke ændringer kan være nødvendige afhængigt af plantearten og den eksperimentelle opsætning.

* Sørg for, at alle løsninger tilberedes friske og opbevares korrekt.

* Brug reagenser af høj kvalitet til nøjagtige resultater.

* Kontrol for baggrundsabsorbans ved at måle absorbansen af ​​emner uden enzymekstrakt.

* Gentag assayet mindst tre gange for at sikre reproducerbarhed.

griess reagens:

* Griess-reagenset bruges til at detektere nitrit ved at reagere med den for at producere et lilla farvet azo-farvestof.

* Forskellige Griess -reagenser kan bruges, så henvis til den specifikke protokol til forberedelse og brug.

Alternative metoder:

* Andre metoder til måling af nitratreduktaseaktivitet inkluderer anvendelse af nitrat som substrat og detektering af reduktion af nitrat til nitrit.

* spektrofotometrisk måling kan anvendes til direkte at måle ændringen i NADH -koncentration over tid.

Fortolkning:

Nitratreduktaseaktiviteten er en indikator for plantens evne til at reducere nitrat til nitrit, hvilket er et afgørende trin i nitrogenassimilering. Sammenligning af aktiviteten i forskellige væv eller under forskellige forhold kan afsløre værdifuld information om plantens nitrogenmetabolisme.

Yderligere information:

* Protokolændringer for specifikke plantearter eller betingelser: Se relevant videnskabelig litteratur eller kontakteksperter for vejledning.

* Fejlfinding: Konsulter fejlfindingsvejledninger eller konsulter eksperter, hvis du støder på problemer med assayet.

Denne protokol tilvejebringer en generel ramme til måling af nitratreduktaseaktivitet ved anvendelse af natriumnitrit som standard. Tilpas det til dine specifikke behov, og sørg for nøjagtige resultater.