Bestemmelse af den optimale temperatur for enzymaktivitet

Af Tricia Lobo, Opdateret 30. august 2022

Enzymer fremskynder kemiske reaktioner ved at sænke aktiveringsenergien. De fleste enzymer fungerer bedst mellem 35°C og 40°C, et område hvor øget kinetisk energi øger substratbinding uden at forårsage denaturering. Overskridelse af dette vindue kan irreversibelt udfolde proteinet og standse aktiviteten.

Trin 1:Vælg en kvantitativ analyse

Vælg en pålidelig metode til at kvantificere produktdannelse ved hvert temperaturpunkt. Almindelige muligheder omfatter spektrofotometri – konvertering af absorbans til koncentration ved hjælp af en kalibreringskurve – eller fluorescensassays, der korrelerer intensitet med produktmængde.

Trin 2:Forbered reaktionssystemet

Kombiner enzym og substrat i et forseglet scintillationshætteglas for at forhindre fordampning. Placer hætteglasset i et større bæger med vand og monter bægeret på en varmeplade. Indsæt et kalibreret termometer i bægerglasset for at overvåge opløsningens temperatur nøjagtigt.

Trin 3:Prøve på tværs af temperaturområdet

Begynd med at tage en 100‑µL alikvot ved omgivelsestemperatur (~25°C). Aktiver varmepladen og opsaml 100‑µL prøver ved trinvise temperaturer – 30,5°C, 31°C, 31,5°C osv. – indtil de når 40°C. Sørg for, at hver prøve behandles med det samme for at undgå temperaturdrift.

Trin 4:Analyser produktkoncentration

Bestem produktkoncentrationen for hver alikvot ved hjælp af det valgte assay. Plot koncentration (eller reaktionshastighed) i forhold til temperatur. Toppen af ​​denne kurve identificerer enzymets optimale temperatur. Temperaturer over 40°C viser typisk et fald i aktivitet, hvilket indikerer begyndende denaturering.

Påkrævede materialer

• Enzym
• Substrater
• Produktanalysesæt (spektrofotometrisk eller fluorescerende)
• Scintillationshætteglas med låg
• Bægerglas
• Varmeplade
• Kalibreret termometer