Præcis RNA-kvantificering:Sådan beregnes koncentration

Af Anne Mullenniex Opdateret 24. marts 2022

Kvantificer din RNA-prøve ved at måle dens absorbans af ultraviolet lys (UV). Et nano-dråbe spektrofotometer vil kun bruge en eller to mikroliter af din prøve, som du kan genvinde. Andre spektrofotometre kræver en meget større prøve. Ekstinktionskoefficienten for nukleotider ved en UV-bølgelængde på 260 nm i en 1 cm lysbane er 20. Baseret på denne ekstinktionskoefficient er absorbansen af ​​40 µg/ml RNA under de samme betingelser én. Ved hjælp af disse oplysninger kan du beregne koncentrationen af din RNA-prøve.

Trin 1

Lav om nødvendigt en fortynding af din prøve. En standardfortynding for en mikrokuvette er 1:40. Lav denne fortynding ved at tilføje 2 µL RNA-prøve til 78 µL sterilt vand.

Trin 2

Følg protokollerne for dit specielle spektrofotometer for at kalibrere maskinen ved at bruge en blank og derefter bestemme den optiske tæthed af din prøve ved en UV-bølgelængde på 260nm.

Trin 3

Multiplicer absorbansen af din prøve med din fortyndingsfaktor med 40 μg RNA/ml. Ligningen ville være:"RNA-koncentration (µg/ml) =(OD260) x (fortyndingsfaktor) x (40µg RNA/ml)/(1 OD260-enhed)" (Hofstra.edu) For eksempel:Hvis du fortyndede din prøve med 1:40 og din absorbansaflæsning var 0,08,0, ville du gange 8 =040 x 2 µg/ml =0,13 µg/µL

Trin 4

Find ud af renheden af din prøve ved at tage endnu en absorbansaflæsning ved 280nm UV-bølgelængde. Forholdet OD 260/OD 280 vil indikere, om – og på hvilket niveau – din prøve er forurenet med protein eller phenol. Et resultat på 1,8 til 2,0 indikerer kvalitets-RNA.

Ting påkrævet

• Spektrofotometer
• Lommeregner

TL;DR (for lang; læste ikke)

Glem ikke at kalibrere dit spektrofotometer. At køre en hurtig elektroforetisk gel vil bekræfte dine specifikationer.

Advarsel

Antag ikke, at din prøve er ren. At tage sig tid til et OD260/OD280-forhold sparer tid og penge på vejen.