Nanocontainere til nanocargo:Levering af gener og proteiner til cellulær billeddannelse, genetisk medicin og kræftbehandling

(Phys.org) —Ved at indlæse et hvilket som helst specifikt protein og nukleinsyre i en icosaedrisk fag T4 capsid-baseret nanopartikel, den resulterende celleleveringsvehikels ligander kan binde til overfladen af ​​specifikke målvæv for at levere protein/DNA-lasten. (Icosaedriske virale nanopartikler er evolutionære proteinskaller samlet i en hierarkisk rækkefølge, der resulterer i et stabilt proteinlag og et indre rum til at rumme nukleinsyrer og proteiner; et kapsid er proteinskallet af en virus.) Teknikken har lægemiddel- og gen- leveringsapplikationer til humane sygdomme, diagnostisk og cellulær billeddannelse, og andre medicinske områder. For nylig, forskere ved US Naval Research Laboratory, Washington, DC og University of Maryland i Baltimore pakkede T4 nanopartikler in vivo med aktiv cyklisk rekombination, eller Cre, rekombinase (et genetisk rekombinationsenzym, der bruges til at manipulere genomstruktur og kontrollere genekspression) og in vitro med fluorescerende mCherry (et fluorescerende protein, der bruges som markør, når det er mærket til molekyler og cellekomponenter) ekspressionsplasmid-DNA, og leverede disse nanopartikler til kræftceller:Når de blev frigivet til celler i nærværelse af både DNA og protein, rekombinasen øger mCherry-ekspression ved cirkularisering (dvs. at ændre det pakkede lineære DNA til en cirkulær løkke). Forskerne fastslår, at denne effektive og specifikke pakning i capsider og udpakning af både DNA og protein med frigivelse af de enzymatisk ændrede protein/DNA-komplekser fra nanopartiklerne til celler har potentiale i adskillige downstream-applikationer såsom genetiske og cancerterapeutiske midler.

Dr. Jinny L. Liu diskuterede papiret, at hun, Prof. Lindsay W. Black og deres medforfattere udgivet i Proceedings of the National Academy of Sciences USA . "Icosaedriske virale nanopartikler er i det væsentlige 100 nm gange 80 nm nanocontainere, der gør det muligt at pakke eksogent genetisk materiale in vitro gennem nukleinsyremaskineri, der generelt kun tillader lineær DNA/RNA at blive pakket gennem en portalkanal, " fortæller Liu Phys.org . "Imidlertid, in vitro proteinemballage er generelt umuligt, fordi der for de fleste virale nanopartikler ikke er noget proteinpakkemaskineri, der kan sammenlignes med nukleinsyrepakkemaskineri." Mens protein kan være kemisk tværbundet til kapsidets indre overflade, dette forventes at føre til proteindenaturering og tab af enzymatisk aktivitet.

Når det er sagt, naturen har udviklet løsninger på denne proteinemballage gåde. I løbet af in vivo viral capsid samling, Liu forklarer, nogle bakterielle vira, eller bakteriofager, målproteiner i procapsiderne Før nukleinsyren er pakket for at udstøde proteinerne med nukleinsyren, derved lette infektion i forbindelse med nukleinsyren. (En procapsid, eller prohead, er en umoden viral kapsidstruktur dannet i de tidlige stadier af selvsamling af nogle bakteriofager. Produktion og samling af stabile proheads er en væsentlig forløber for bakteriofag-genompakning.) Kun nogle få fager har velkarakteriseret in vivo proteinpakkesystemer, og fag T4 er bedst karakteriseret. "Prof. Blacks laboratorium på UMB og mit laboratorium på NRL har vist, at ikke kun et specifikt fremmed enzym – cyklisk rekombinations (Cre) rekombinase – kan pakkes ind i capsidet in vivo , men også at det er aktivt i kapsiden." Denne aktivitet blev demonstreret ved at vise religeringen (gensammenføjningen af ​​to DNA-strenge eller andre molekyler ved hjælp af en fosfatesterbinding) af pakket lineært DNA flankeret med to Cre-rekombinationssteder.

Papiret viser, at den betydelige plads i en T4 nanocontainer rummer det aktive Cre-enzym sammen med eksogent DNA. "For potentielle anvendelser, T4 kan pakke op til 50 kb eksogent lineært DNA indeholdende ønskede gener i fuld længde sammen med rekombinaser, enten Cre eller λ-røde proteiner, for specifik homolog rekombination i kromosomet, " noterer Liu. ( Homolog rekombination er en type genetisk rekombination, hvor nukleotidsekvenser udveksles mellem to ens eller identiske DNA-molekyler.) "Vi forventer, at cas9-enzymet kan indkapsles på en sammenlignelig måde - og faktisk, mindst otte forskellige proteiner er blevet indkapslet på denne måde. Gennem homolog rekombination, vores system kan tillade det korrigerede gen at erstatte det muterede gen på dets oprindelige placering i kromosomet eller ved præcist at slå de overaktive gener i stamceller ud." Liu påpeger, at T4 leveringsvektoren er sikrere og bedre kontrolleret end andre virale leveringsgener terapi, såsom dem, der leverer gener ved hjælp af infektiøse animalske virale vektorer til tilfældigt at indsætte genet i kromosomet.

I deres papir, forfatterne rapporterer, at T4 capsid NP-genekspression og proteinleveringssystemet kan være komplementært til eller anvendes i forbindelse med genterapi baseret på RNA Cas og taran nuklease. (Cas-gener koder for proteiner relateret til DNA-loci, der indeholder korte gentagelser af basesekvenser kendt som Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, eller CRISPRs.) "T4 nanopartikelekspressionssystemet kan nemt komplementere Cas9 og taran nuklease-baseret rekombination ved at pakke det lineære cas9, target-sgRNA plasmid DNA, og Cre rekombinase – eller endda ligase, et enzym, der letter sammenføjningen af ​​DNA-strenge – og leverer de resulterende T4-nanopartikler ind i de modtagende eukaryote celler med høj specificitet ved at anvende SOC og HOC, " fortæller Liu Phys.org . (SOC og HOC er dispensable T4 capsidproteiner.) "Ved at vise de målrettede ligander (bindingsmolekyler) på overfladen, T4 capsid-genekspressionen og proteinsystemet vil være i stand til effektivt at levere Cas9- og sgRNA-plasmiderne sammen til de ønskede modtagerceller. Relevante enzymatisk aktive proteiner Cas9, lambda exonuklease, lambda beta-protein og andre kan leveres direkte på samme tid fra T4-nanopartiklerne."

Liu tilføjer, at hendes laboratorium også har studeret cellebilleddannelse og lægemiddel/genlevering til eukaryote celler ved hjælp af T4 haleløse nanopartikler, som forskerne påviste kan trænge ind i de eukaryote celler uden at forårsage celledød.

Et specifikt eksempel på potentielle downstream-lægemiddel- og genterapeutiske anvendelser som følge af den nye tilgang er levering af det toksiske protein og lineære plasmid, der producerer neutraliserende peptider eller antistoffer til målrettede cancerceller, der viser specifikke cancermarkører ved hjælp af højaffinitets-SOC + HOC-markørbindende proteiner på overflade af kapsider, mens et andet eksempel er at bruge systemet til HIV-genterapi.

Liu tilføjer, at der er flere veje til at bruge dette system til genterapi:

• Levering af T4-nanopartikler pakket med rekombinasen (eller ligasen) og lineært plasmid-DNA for at producere gp120 eller interferon for at generere eller booste immunresponset hos patienter
• Leverer T4-nanopartikler pakket med rekombinase (ligase) og det lineære opløselige CD40-ekspressionsplasmid-DNA til T-lymfocytter eller hæmatopoietiske celler for at blokere infektionen af ​​HIV-1
• Inhibering af RNA ved at levere det konstruerede plasmid-DNA, der kan producere lokke-RNA til binding af viral sense-DNA
• Hæmmer protein ved at levere pakkede anti-virale antistoffer og anti-HIV antistof plasmid DNA

Ud over diagnostisk og cellulær billeddannelse, T4 nanopartikelgen-proteinsystemet kan levere reparerede gener til at korrigere menneskelige genetiske sygdomme – f.eks. reversering af adenosindeaminase (ADA) mangel ved at introducere protein-DNA-komplekset til at udtrykke ADA i stamceller. Andre brede forskningsområder påvirket af genterapiteknologier, såsom genetiske defekter, Kræft, neurologiske sygdomme hos voksne, og selve ældningen, kan også have gavn af denne undersøgelse.

Bevæger sig fremad, forskerne ønsker at udvikle flere T4-procapsider, der pakker exonuklease og andre rekombinaser sammen med manipuleret mål-DNA for at demonstrere, at de resulterende T4-capsider kan indsætte genet i en stamcellelinje med en genetisk mangel. "Ud over, " konkluderer Liu, "Vi arbejder på at tilpasse vores system til at levere terapeutiske peptider eller antistoffer til celler udsat for eller inficeret med biotrusselsmidler, såsom proteintoksiner eller vira, effektiv neutralisering af toksineffekter. Behandling og helbredelse af celler og væv udsat for sådanne midler er af stor interesse for vores bioforsvarsforskningssamfund."

© 2014 Phys.org