Multicolour super resolution imaging - En metode til at overvåge dynamisk proteinbinding på subsekund tidsskalaer

Forskere fra Mechanobiology Institute (MBI) ved National University of Singapore har udviklet en ny metode, ved hjælp af superopløselig mikroskopi, at bestemme længden af ​​strakte proteiner i levende celler, og overvåge den dynamiske binding af proteiner, på sub-sekund tidsskalaer. Denne undersøgelse blev offentliggjort i Nano bogstaver i maj 2016.

Celler udsættes konstant for mekaniske kræfter. Disse signaler påvirker cellulær beslutningstagning ved at give information, celler skal bestemme, hvor meget af et bestemt protein de skal producere, hvornår et specifikt gen skal udtrykkes, eller endda om en celle skal flytte sig eller forblive, hvor den er. Sådan information er afgørende, for eksempel, ved at opretholde sundheden, integritet og reparation af væv, når vi bliver ældre. Et tydeligt eksempel på, hvornår celler udsættes for kræfter, er, når vi går. Stræk- eller trækkræfter genereres i vores muskler, og disse føres gennem musklen til bindevæv og knogler. Selvom denne information genereres på vævsniveau, det konvergerer på enkelte celler i disse væv, og detekteres og måles med subcellulær, protein baseret, maskiner.

For at måle de kræfter, der påføres en celle, specialiserede proteiner kan blive deformeret. En almindelig måde at dette sker på er, når et protein strækkes, ligesom hvordan et elastikbånd strækker sig, når det udsættes for trækkræfter. Udstrækning af proteiner kan afsløre områder inden i dem, der ellers er skjulte. Disse områder kan tjene som docking-steder til vedhæftning af andre proteiner. Dette fører til en sneboldeffekt, hvor flere og flere proteiner er i stand til at binde, og større molekylære komplekser eller maskiner dannes for at formidle en specifik cellulær funktion. Dette fænomen blev for nylig udforsket af MBI-direktør, Professor Michael Sheetz, Seniorforsker Dr. Felix Margadant og ph.d.-studerende Ms Xian Hu (Edna), i arbejdet fokuseret på karakterisering af strækningen af ​​et kraftfølende protein kendt som talin, og fastslå den effekt det har på bindingen af ​​et andet protein kaldet vinculin.

Selvom flere undersøgelser har vist den force-inducerede strækning af talin- og talin-vinculin-binding in vitro, samtidig visualisering af både disse hændelser og deres korrelation til specifikke cellulære funktioner var ikke tidligere mulig i levende celler på grund af de hurtige tidsskalaer, hvor de forekommer. Også, at udføre multicolor super opløsning billeddannelse i levende celler er stadig meget vanskeligt. For at overkomme disse udfordringer, Prof Sheetz og fru Hu udviklede en roman, og meget avanceret billeddannelsesmetode med super opløsning, som gjorde det muligt for dem samtidig at overvåge talinlængde i levende celler, såvel som dynamikken i vinculinbinding, på enkeltmolekylniveau og millisekunders tidsskala.

Ved at vedhæfte forskellige fluorescerende molekyler (GFP og mCherry), til hver ende af talin og en tredje fluorofor (Atto655) til vinkulin, forskerne kunne overvåge den præcise subcellulære placering af hvert protein, og bekræft, at da talin blev strakt, vinculin bundet til nyligt eksponerede steder. Interessant nok, deres fund afslørede ofte grupperet binding, med fem eller flere vinculinmolekyler, der binder til talin på et sekund. I øvrigt, bindingen af ​​de første par vinkuliner syntes energisk at favorisere den successive binding af flere vinkulinmolekyler. Korrelering af vinculinbindingsdynamik med mængden af ​​talinstrækning, forskerne bemærkede, at maksimal vinculinbinding forekom i den ene ende af talin (den N-terminale region), da talin blev strakt til cirka 180 nm.

At forstå, hvordan talin og vinculin reagerer på strækkekræfter, er afgørende for at forstå, hvordan celler reagerer på kræfter i vores kroppe. I dette tilfælde, begge proteiner findes i større molekylære maskineri kaldet fokale adhæsioner, som fysisk forbinder det indre af en celle med det materiale, der omgiver cellen, den ekstracellulære matrix. Fokale adhæsioner fungerer primært som signalformidlingscentre, og den information, de overfører, kan inducere cellevækst og cellebevægelse. Når denne signalbehandling afbrydes, eller ikke er reguleret, sygdomstilstande opstår og kroppens evne til at hele sår, eller opretholde vævsintegritet, når vi bliver ældre, bliver svækket.

Selvom det er vigtigt for at lette disse bredere cellulære og vævsprocesser, talin-vinculin-interaktionen er blot en af ​​mange protein-interaktioner, der reagerer på kraft. Det er håbet, at denne nyligt beskrevne metode vil bane vejen for, at forskere kan dissekere andre proteininteraktioner, både inden for fokale adhæsioner, og i andre molekylære maskiner, at forbedre vores forståelse af de mange kraftdrevne cellulære processer, der opstår under udvikling og fortsætter frem til aldring.