Team opdaterer den søde adskillelsesmetode fra 1950'erne for at rense nanopartikler fra organismer

Nogle gange giver old-school metoder de bedste måder at studere banebrydende teknologi og dens indvirkning på den moderne verden.

At give en 65-årig laboratorieteknik en ny rolle, forskere ved National Institute of Standards and Technology (NIST) har udført den reneste adskillelse til dato af syntetiske nanopartikler fra en levende organisme. Den nye NIST -metode forventes at forbedre eksperimenter væsentligt med hensyn til de potentielle miljø- og sundhedsmæssige konsekvenser af disse fremstillede enheder. Det vil give forskerne mulighed for mere præcist at tælle, hvor mange nanopartikler, der faktisk er blevet indtaget af organismer, der er udsat for dem.

Et papir, der beskriver den nye metode, vises i det aktuelle nummer af tidsskriftet ACS Nano .

Den almindelige rundorm Caenorhabditis elegans er i de senere år blevet brugt som en levende model for laboratorieundersøgelser af, hvordan biologiske og kemiske forbindelser kan påvirke flercellede organismer. Disse forbindelser omfatter manipulerede nanopartikler (ENP'er), stykker materiale mellem 1 og 100 nanometer (milliarddele af en meter, eller omkring 1/10, 000 diameteren af ​​en rød blodlegeme). Tidligere forskning har ofte fokuseret på at kvantificere mængden og størrelsen af ​​konstruerede nanopartikler indtaget af C. elegans. Måling af de nanopartikler, der faktisk gør det til en organisme, betragtes som en mere relevant indikator for potentiel toksicitet end blot mængden af ​​ENP'er, som ormene udsættes for.

Traditionelle metoder til optælling af indtaget ENP har givet tvivlsomme resultater. I øjeblikket, forskere udsætter C. elegans for metal ENP'er såsom sølv eller guld i opløsning, skyl derefter de overskydende partikler væk med vand efterfulgt af centrifugering og frysetørring. En del af den producerede "rensede" prøve undersøges derefter typisk ved en teknik, der bestemmer mængden af ​​tilstedeværende metal, kendt som induktivt koblet plasmamassespektrometri (ICP-MS). Det giver ofte ENP-tal i titusindvis pr. orm; imidlertid, disse tal synes altid for høje for NIST-forskere, der arbejder med C. elegans.

"Da ICP-MS vil detektere alle de nanopartikler, der er forbundet med ormene, både dem, der indtages og dem, der forbliver knyttet eksternt, vi formoder, at sidstnævnte er det, der får 'ENP'erne' per-orm til at tælle så højt, " sagde NIST analytiske kemiker Monique Johnson, hovedforfatteren på ACS Nano -papiret. "Da vi kun ønskede at kvantificere de indtagne ENP'er, en mere robust og pålidelig adskillelsesmetode var nødvendig. "

Heldigvis, løsningen på problemet var allerede i laboratoriet.

I løbet af at dyrke C. elegans til ENP-eksponeringseksperimenter, Johnson og hendes kolleger havde brugt saccharosedensitetsgradientcentrifugering, et årtier gammelt og etableret system til ren adskillelse af cellulære komponenter, at isolere ormene fra snavs og bakterier. "Vi spekulerede på, om den samme proces også ville give os mulighed for at udføre en organisme-fra-ENP-adskillelse, så jeg designede en undersøgelse for at finde ud af, " sagde Johnson.

I deres eksperiment, NIST-forskerne udsatte først separate prøver af C. elegans for lave og høje koncentrationer af to størrelser guld nanosfærer, 30 og 60 nanometer i diameter. Forskerne satte hver af prøverne i en centrifuge og fjernede supernatanten (flydende portion), efterlader ormene og ENP'erne i de resterende pellets. Disse blev centrifugeret to gange i en saltopløsning (snarere end bare vand som i tidligere separationsmetoder), og derefter centrifugeret igen, men denne gang, gennem en unikt designet saccharosedensitetsgradient.

"Fra top til bund, vores gradient bestod af et saltopløsningslag til at fange overskydende ENP'er og tre stadig mere tætte lag af saccharose [20, 40 og 50 procent] for at isolere C. elegans, " forklarede Johnson. "Vi fulgte gradienten op med tre vandskylninger og med centrifugeringer for at sikre, at kun orme med indtaget ENP'er, og ikke saccharoseseparationsmediet med overskydende ENP'er, ville gøre det til den endelige pellet."

Analyse af rækkevidden af ​​masser i de ultrarensede prøver viste guldniveauer mere i overensstemmelse med, hvad forskerne forventede ville blive fundet som indtaget ENP'er. Eksperimentel validering af NIST -separationsmetodens succes kom, da ormene blev undersøgt detaljeret under et scanningselektronmikroskop (SEM).

"For mig, eureka-øjeblikket var, da jeg første gang så guld ENP'er i tværsnitsbillederne taget fra C. elegans-prøverne, der var blevet behandlet gennem saccharosedensitetsgradienten, " sagde Johnson. "Jeg havde drømt om at finde ENP'er i ormens fordøjelseskanal, og nu var de der virkelig!"

SEM-billederne i høj opløsning gav også visuelt bevis på, at kun indtagne ENP'er blev talt. "Ingen ENP'er var knyttet til neglebåndet, eksoskelet af C. elegans, i enhver af saccharosedensitetsgradientprøverne, "Sagde Johnson." Da vi undersøgte orme fra vores kontroleksperimenter [behandlet ved hjælp af den traditionelle no-gradient, separationsmetode, der kun kan skylles med vand], der blev fundet en række nanosfærer knyttet til neglebåndet.

Nu hvor det er blevet demonstreret med succes, NIST-forskerne planlægger at forfine og yderligere validere deres system til evaluering af C. elegans' optagelse af ENP'er. "Forhåbentlig, vores metode vil blive et nyttigt og værdifuldt værktøj til at reducere målevariabiliteten og prøveudtagningsbias, der kan plage miljømæssige nanotoksikologiske undersøgelser, " sagde Johnson.