Forskere belyser området for mikroskopi med nanopartikel-buckyswitch

Visualisering af biologiske celler under et mikroskop blev netop gjort klarere, takket være forskning udført af kandidatstuderende Yifei Jiang og hovedefterforsker Jason McNeill fra Clemson Universitys afdeling for kemi.

Med hjælp fra Rhonda Powell og Terri Bruce fra Clemson's Light Imaging Facility, holdet var i stand til at udvikle en nanopartikel "switch", der fluorescerer for at skærpe opløsningen af ​​mikroskopiske billeder, der afbilder små cellulære strukturer. Som for nylig offentliggjort i Nano bogstaver , denne switch forbedrer en billeddannelsesmetode, der vandt Nobelprisen i kemi i 2014.

Fordi cellulære strukturer udsender lys ved bølgelængder mindre end 400-700 nanometer på det elektromagnetiske spektrum, de fremstår ofte slørede gennem et lysmikroskop. Denne begrænsning omtales som diffraktionsgrænsen, og det opstår på grund af lysets bølgeegenskaber. Når lys passerer rundt om strukturer i biologiske celler, det diffrakterer, eller bøjninger, til et punkt, som lysmikroskoper ikke klart kan løse. Den prisvindende billeddannelsesmetode i 2014 - enkeltmolekyle lokaliseringsmikroskopi - blev opfundet for at overgå denne begrænsning.

"Enkeltmolekyle lokaliseringsmikroskopi er baseret på molekylære 'photoswitches' - fluorescerende molekyler, som du kan tænde og slukke, som en lyskontakt, at slå diffraktionsgrænsen, " sagde McNeill. "Med denne billedbehandlingsmetode, prøven afbildes et fluorescerende molekyle ad gangen, og en computer bruges til at konstruere et billede, der er meget skarpere, end hvad du kunne få med et almindeligt lysmikroskop."

Fangsten, imidlertid, er, at fluorescensen fra fotoswitches i bedste fald er svag, med kun en lille forbedring i billedopløsning. Enkeltmolekyle lokaliseringsmikroskopi kræver også specialiseret udstyr, som kan være dyrt at anskaffe.

Cue the "buckyswitch" - Clemson-forskernes forbedrede version af en fotoswitch. Denne nye type nanopartikel bevarer fotoswitchens tænd-sluk-evne, men er 10 gange lysere og nemmere at bruge. Det giver også mikroskoper mulighed for at optage billeder op til terapixel-niveau. (Det svarer til en trillion pixels, eller en million megapixels.)

"Disse nanopartikler er de første fotoswitches, der opnår præcision ned til cirka 1 nanometer, hvilket i høj grad forbedrer opløsningen af ​​superopløsningsbilleder, " sagde Jiang. "Også, vores metode kræver kun én excitationslyskilde, hvor konventionelle superopløsningsteknikker kræver to lasere; dermed, vi har forenklet mikroskopopsætningen."

Jiang samlede buckyswitch ud af et lysstofrør, halvledende konjugeret polymer kompleksbundet med et kemisk derivat af buckminsterfulleren:en fodbold-bold-formet form af kulstof.

"Den svære del af at lave en fluorescerende nanopartikel, som du kan tænde og slukke, er, at der er masser af områder, der udsender fluorescens på én gang, " sagde McNeill. "I tilfælde af fluorescerende konjugeret polymer, der er snesevis eller hundredvis af kædesegmenter. Du kan prøve at lave en masse små skift for hvert segment, men det er svært at få dem alle til at slukke på samme tid. Du kan ikke få dem synkroniseret."

Ved at tilføje derivatet af buckminsterfulleren, kaldet PCBM, til fremstilling af buckyswitches, der dannes en "master switch", der regulerer atomladningen af ​​polymerens segmenter, dermed synkronisere fluorescens. PCBM er i stand til at gribe elektroner fra polymersegmentet, giver segmentet en samlet positiv ladning. Denne positive ladning reducerer fluorescensen af ​​nærliggende segmenter, som har en dominoeffekt, der slukker for fluorescens i hele nanopartiklerne.

Bruce - hvis baggrund krydser emnerne kemiteknik, anvendt biologi, cellebiologi, og erfaring med undervisning og industri - sammenligner denne billeddannelsesmetode med udsigten til en hængebro om natten.

"Broens ledninger er ofte belyst, og når du står langt væk fra broen, lysene ligner et kontinuerligt 'reb' af lys, i stedet for individuelle pærer. Imidlertid, hvis du kan få pærerne til at blinke - sådan at kun hver anden pære er 'tændt' til enhver tid - kan dine øjne skelne de enkelte pærer langt væk, " sagde Bruce. "Grundlaget for superopløsningsmikroskopi ligger i evnen til at få fluorescerende etiketter til at 'blinke' ligesom lysene på broen. Det arbejde, som Dr. McNeills laboratorium udfører, er afgørende for udviklingen af ​​denne teknologi, fordi den fokuserer på at gøre de enkelte blink meget lysere, så vores nuværende fotondetektorer faktisk kan se blinkene. Hvis vi kan se blinkene med et kamera eller en anden fotondetektor, vi kan kortlægge, hvor blinket sker, og skab et billede, hvor vi kan skelne to lyspunkter, der er inden for 10-20 nanometer fra hinanden."

Når buckyswitchen var syntetiseret, Jiang testede det i E. coli, men ikke før man har udviklet et unikt vækstmedie til bakterierne. Typisk, E. coli dyrkes i medier, der er autofluorescerende, hvilket betyder, at det naturligt udsender lys. Uden de rette medier, buckyswitchens fluorescens ville blive sløret af baggrundslys, noget, som Powell understregede.

"En undersøgelse som den Yifei udførte krævede meget lidt baggrundsfluorescens, så jeg undersøgte mediekomponenter, der ville være mindre tilbøjelige til at være autofluorescerende og udarbejdede en 'opskrift' på en ikke-konventionel, færre autofluorescerende næringsmedier til bakteriekultur, " sagde Powell, som studerede både biologiske videnskaber og mikrobiologi på Clemson, før han blev forskningslaboratorieleder for Clemson Light Imaging Facility. Powell og Bruce arbejdede også på at forsyne Jiang med E. coli til undersøgelsen.

Efter at alle de nødvendige komponenter var fjernet, Jiang fæstede nanopartikel-buckyswitches til overfladen af ​​E. coli. Som håbet, buckyswitches udsendte små lysglimt, hvilket gjorde det muligt for forskerne at bestemme deres præcise positioner. De satte derefter hvert lysglimt sammen for at rekonstruere formen af ​​E. coli, giver et superopløsningsbillede.

"Vi håber, at dette gennembrud i sidste ende vil være i stand til at hjælpe forskere med at tackle vanskelige problemer inden for biologi, fører til gennembrud i forståelsen og behandlingen af ​​sygdom, " sagde Clemson-holdet.

Holdet designede buckyswitches til at fungere med standard fluorescerende mikroskoper og gratis software, der er tilgængelig online, gør teknologien billig og tilgængelig for laboratorier over hele verden.

Deres udgivelse, med titlen "Forbedret superopløsningsbilleddannelse ved hjælp af telegrafstøj i organiske halvledernanopartikler, " er omtalt i 14. juni-udgaven af Nano bogstaver .