Ny klasse af crosslinker-fri nanofiber biomaterialer fra Hydra nematocyst proteiner

Nematocyster er stikkende organeller af cnidarians, der har bemærkelsesværdige mekaniske egenskaber til at gennemgå 50 procent volumenændringer under eksplosiv exocytose (proces, hvorved celler udskiller affald og store molekyler), mens den modstår osmotiske tryk over 100 bar. Forskere havde for nylig identificeret to nye proteinkomponenter, der opbyggede nematocystvæggen i Hydra til at omfatte (1) et cnidarian prolin-rigt protein-1 (CPP-1) med et stift polyprolin-motiv, og (2) et elastisk Cnidoin, der har et silkelignende domæne. I en ny undersøgelse, nu på Videnskabelige rapporter , Theresa Bentele og et team af forskere i afdelingerne for medicin, Molecular Evolution and Genomics og Institute of Physical Chemistry i Tyskland, Australien og Japan, udtrykte rekombinante Cnidoin- og CPP-1-proteiner i Escherichia coli .

De sammenlignede elasticitetsmodulet for spontant tværbundne bulkproteiner med det for isolerede nematocyster. Forskerne optimerede systematisk fremstillingen af ​​ensartede proteinnanofibre ved hjælp af elektrospinning og præparative forhold. Begge fibre forblev stabile selv efter streng vask og nedsænkning i bulkvand, på grund af samtidig tværbinding af cysteinrige domæner. De resulterende nanofibre var klart forskellige fra andre proteinnanofibre, der var ustabile uden kemiske tværbinderprocedurer. Efter kvantitativ vurdering af mekaniske egenskaber, de undersøgte anvendelser af Cnidoin og CPP-1 nanofibre til at fremme væksten af ​​humane mesenkymale stamceller.

Hydra nematocyster omfatter fire varianter, der udvikler sig i kropssøjlen af ​​polypper i specialiserede celler kendt som nematocytter. Kapselvæggens enestående mekaniske sejhed gør nematocyster unikke til at danne bioinspirerede materialer i laboratoriet. Kapslen indeholder proteinkomplekser tværbundet af intermolekylære disulfidbindinger mellem cysteinrige domæner (CRD), som kan bruges som en alsidig tværbinder til at skabe lineære eller forgrenede polymerer blandt forskellige proteiner. Forskerne havde allerede identificeret to nye kapselproteiner, herunder CPP-1 og Cnidoin, mens de studerede Hydra nematocyster i deres tidligere arbejde. Potentialet til at kombinere elastisk Cnidoin og stive CPP-1-proteiner var en lovende strategi til at designe nye biomaterialer, der er i stand til at danne stabile strukturer med spontan tværbinding for at realisere enestående fleksibilitet og sejhed, svarende til biologiske nematocystkapsler. Syntetiske bioinspirerede protein nanofibre har fået stigende opmærksomhed som en kunstig matrix til dyrkning af stamceller til vævstekniske anvendelser. Elektrospinning tilbyder en almindelig metode til at fremstille sådanne fibre ved hjælp af silkeproteiner, kollagen og gelatine. De tynde fiberprodukter har flere anvendelser inden for sårheling og vævsteknologi.

I nærværende arbejde, Bentele et al. introducerede en ny klasse af syntetiske tværbinderfrie nanofibre baseret på Hydra nematocyst-proteinerne CPP-1 og Cnidoin ved hjælp af elektrospinning. Baseret på den spontane tværbindingskapacitet af CRD'er optimerede de systematisk de forberedende betingelser for at biomanipulere tværbinderfrie proteinnanofibre, der er stabile under vand med potentielle anvendelser til human stamcellekultur. Forskerholdet opnåede repræsentative immunfluorescensbilleder af en Hydra konjugeret med CPP-1 (grøn) og Cnidoin (rød) antistoffer for at co-lokalisere proteinerne i kapselvæggen. Billederne indikerede tilstedeværelsen af ​​Cnidoin som mere tæt pakket inden for modne nematocystvægge sammenlignet med CPP-1. Derefter, Bentele et al. brugte Western blot-metoder til at identificere de isolerede native nematocystkapsler og rekombinante proteiner (proteiner udtrykt i andre organismer); som de producerede i E. coli. Resultaterne indikerede betydelige post-translationelle modifikationer af CPP-1 i Hydra. De bekræftede resultaterne under anvendelse af CPP-1-proteinet som udtrykt i E. coli og udledte både CPP-1 og Cnidoin til at være strukturelle proteiner af nematocystvæggen integreret under dannelse eller morfogenese.

Forskerne testede derefter de mekaniske egenskaber af Hydra nematocyster og bulkproteiner ved hjælp af scanning elektronmikroskopi (SEM) og atomkraftmikroskopi (AFM). Forskerne udtog fordelingen af ​​elasticitetsmodulerne og målte yderligere elasticiteten af ​​renset rekombinant CPP-1 (reCPP-1) og Cnidoin (reCnidoin) udtrykt i E. coli. Derefter optimerede de nanofiberproduktionen ved at introducere polyethylenglycol (PEG) 900 kDa til den rene opløsning for at opnå højere viskositet af produktet. Holdet undersøgte indflydelsen af ​​relativ luftfugtighed - som signifikant påvirkede kvaliteten af ​​nanofibre, mens ionstyrken eller ledningsevnen af ​​spindeopløsninger ikke viste nogen indflydelse på nanofibrene.

Baseret på de foreløbige materialeudviklings- og karakteriseringsresultater, Bentele et al. fremstillede proteinnanofibre ved elektrospinning af protein-PEG-opløsningen på glasdækglas. De nyspundne recCPP-1-PEG nanofibre viste en ensartet bredde og højde over en 50 x 50 µm ² område og viste et ensartet elasticitetsmodul. Holdet målte derefter overfladetopografien, opnået et elasticitetskort og en karakteristisk kraftindrykningskurve for reCPP-1 og reCnidoin nanofibre (a) i luft, (b) i luft efter vask med vand, og i (c) fysiologisk bufferopløsning. De kunne fjerne PEG ved at vaske med vand for at opnå en signifikant reduceret fibertykkelse for reCnidoin nanofibre, selvom dimensionerne var mindre udtalte sammenlignet med reCPP-1 efter vandbehandling.

Imidlertid, fibrene opløstes ikke helt efter vask med vand og beholdt deres elasticitetsmoduler. Resultaterne tyder på, at de to rekombinante proteiner kan etablere stabile nanofibre ved spontant at danne disulfidbindinger mellem CRD-termini (cysteinrigt domæne). De rekombinante Hydra nematocyst-proteiner produceret i dette arbejde dannede også ensartede og stabile nanofibre gennem naturligt forekommende CRD'er i luft og i fysiologisk buffer. Holdet undersøgte anvendelserne af disse nanofibre med stabil human mesenkymal stamcellekultur i 20 dages inkubation, hvor omkring 95 procent af cellerne viste cellevækst og levedygtighed på de nye bioinspirerede materialer.

På denne måde Theresa Bentele og kolleger foreslog et nyt syntetisk crosslinker-frit nanofiber biomateriale, bioinspireret af nematocystkapselproteinerne fra Hydra. De udtrykte rekombinante proteiner af to nyligt identificerede CPP-1 og Cnidoin nematocyst kapselproteiner i E. coli og fremstillede nanofibre via elektrospinning. Som et resultat af de cysteinrige domæner (CRD), de elektrospundne fibre kunne spontant tværbinde via disulfidbindinger. ReCPP-1 og reCnidoin rekombinante proteiner dannede ensartede nanofibre, der var stabile i vand direkte efter elektrospinning. De nye materialekonstruktioner viste potentiale som biokompatible materialer inspireret af den seje og elastiske Hydra nematocyst struktur.

© 2019 Science X Network