Mikroskopiteknik afslører skjulte nanostrukturer i celler og væv

Inde i en levende celle er proteiner og andre molekyler ofte tæt pakket sammen. Disse tætte klynger kan være svære at afbilde, fordi de fluorescerende etiketter, der bruges til at gøre dem synlige, ikke kan kile sig ind mellem molekylerne.

MIT-forskere har nu udviklet en ny måde at overvinde denne begrænsning og gøre disse "usynlige" molekyler synlige. Deres teknik giver dem mulighed for at "de-crowde" molekylerne ved at udvide en celle- eller vævsprøve, før de mærker molekylerne, hvilket gør molekylerne mere tilgængelige for fluorescerende tags.

Denne metode, der bygger på en udbredt teknik kendt som ekspansionsmikroskopi, der tidligere er udviklet ved MIT, skulle gøre det muligt for forskere at visualisere molekyler og cellulære strukturer, som aldrig er set før.

"Det er ved at blive klart, at udvidelsesprocessen vil afsløre mange nye biologiske opdagelser. Hvis biologer og klinikere har studeret et protein i hjernen eller en anden biologisk prøve, og de mærker det på den almindelige måde, mangler de måske hele kategorier af fænomener. ," siger Edward Boyden, Y. Eva Tan professor i neuroteknologi, professor i biologisk ingeniørvidenskab og hjerne- og kognitiv videnskab ved MIT, en Howard Hughes Medical Institute-forsker og medlem af MIT's McGovern Institute for Brain Research og Koch Institute for Integrative Kræftforskning.

Ved hjælp af denne teknik viste Boyden og hans kolleger, at de kunne afbilde en nanostruktur fundet i neuronernes synapser. De afbildede også strukturen af ​​Alzheimers-forbundne amyloid beta plaques mere detaljeret, end det har været muligt før.

"Vores teknologi, som vi kaldte ekspansion afslørende, muliggør visualisering af disse nanostrukturer, som tidligere forblev skjulte, ved hjælp af hardware let tilgængelig i akademiske laboratorier," siger Deblina Sarkar, en assisterende professor i Media Lab og en af ​​hovedforfatterne af undersøgelsen .

Seniorforfatterne til undersøgelsen er Boyden; Li-Huei Tsai, direktør for MIT's Picower Institute for Learning and Memory; og Thomas Blanpied, professor i fysiologi ved University of Maryland. Andre hovedforfattere omfatter Jinyoung Kang, en MIT postdoc, og Asmamaw Wassie, en nylig MIT Ph.D. modtager. Undersøgelsen vises i dag i Nature Biomedical Engineering .

Aftrængning

Billeddannelse af et specifikt protein eller andet molekyle inde i en celle kræver mærkning af det med et fluorescerende tag båret af et antistof, der binder til målet. Antistoffer er omkring 10 nanometer lange, mens typiske cellulære proteiner normalt er omkring 2 til 5 nanometer i diameter, så hvis målproteinerne er for tæt pakket, kan antistofferne ikke komme til dem.

Dette har været en hindring for traditionel billeddannelse og også for den originale version af ekspansionsmikroskopi, som Boyden først udviklede i 2015. I den originale version af ekspansionsmikroskopi satte forskere fluorescerende mærker til molekyler af interesse, før de udvidede vævet. Mærkningen blev udført først, til dels fordi forskerne skulle bruge et enzym til at hakke proteiner i prøven, så vævet kunne udvides. Dette betød, at proteinerne ikke kunne mærkes efter vævet var udvidet.

For at overvinde den forhindring måtte forskerne finde en måde at udvide vævet på, mens de efterlod proteinerne intakte. De brugte varme i stedet for enzymer til at blødgøre vævet, hvilket tillod vævet at udvide sig 20 gange uden at blive ødelagt. Derefter kunne de adskilte proteiner mærkes med fluorescerende tags efter ekspansion.

Med så mange flere proteiner tilgængelige for mærkning, var forskerne i stand til at identificere små cellulære strukturer i synapser, forbindelserne mellem neuroner, der er tæt pakket med proteiner. De mærkede og afbildede syv forskellige synaptiske proteiner, som gjorde det muligt for dem i detaljer at visualisere "nanokolonner" bestående af calciumkanaler på linje med andre synaptiske proteiner. Disse nanokolonner, som menes at hjælpe med at gøre synaptisk kommunikation mere effektiv, blev først opdaget af Blanpieds laboratorium i 2016.

"Denne teknologi kan bruges til at besvare en masse biologiske spørgsmål om dysfunktion i synaptiske proteiner, som er involveret i neurodegenerative sygdomme," siger Kang. "Indtil nu har der ikke været noget værktøj til at visualisere synapser særlig godt."

Nye mønstre

Forskerne brugte også deres nye teknik til at afbilde beta-amyloid, et peptid, der danner plaques i hjernen på Alzheimers patienter. Ved hjælp af hjernevæv fra mus fandt forskerne ud af, at amyloid beta danner periodiske nanoklynger, som ikke var set før. Disse klynger af amyloid beta inkluderer også kaliumkanaler. Forskerne fandt også amyloid beta-molekyler, der dannede spiralformede strukturer langs axoner.

"I dette papir spekulerer vi ikke i, hvad den biologi kan betyde, men vi viser, at den eksisterer. Det er blot et eksempel på de nye mønstre, som vi kan se," siger Margaret Schroeder, en MIT kandidatstuderende, der er også forfatter til papiret.

Sarkar siger, at hun er fascineret af de biomolekylære mønstre i nanoskala, som denne teknologi afslører. "Med en baggrund inden for nanoelektronik har jeg udviklet elektroniske chips, der kræver ekstremt præcis justering, i nanofab. Men når jeg ser, at Moder Natur i vores hjerne har arrangeret biomolekyler med en sådan præcision i nanoskala, så blæser det mig virkelig," siger hun.

Boyden og hans gruppemedlemmer arbejder nu sammen med andre laboratorier for at studere cellulære strukturer såsom proteinaggregater forbundet med Parkinsons og andre sygdomme. I andre projekter studerer de patogener, der inficerer celler og molekyler, der er involveret i aldring i hjernen. Foreløbige resultater fra disse undersøgelser har også afsløret nye strukturer, siger Boyden.

"Igen og igen ser man ting, der virkelig er chokerende," siger han. "Det viser os, hvor meget vi mangler med klassisk uudvidet farvning."

Forskerne arbejder også på at modificere teknikken, så de kan afbilde op til 20 proteiner ad gangen. De arbejder også på at tilpasse deres proces, så den kan bruges på humane vævsprøver.

Sarkar og hendes team er på den anden side ved at udvikle små trådløst drevne nanoelektroniske enheder, som kan distribueres i hjernen. De planlægger at integrere disse enheder med udvidelse afslørende. "Dette kan kombinere intelligensen fra nanoelektronik med ekspansionsteknologiens nanoskopiske dygtighed til en integreret funktionel og strukturel forståelse af hjernen," siger Sarkar. + Udforsk yderligere

Forskere forstørrer skjulte biologiske strukturer ved at kombinere SRS og ekspansionsmikroskopi