Genmanipulerede celleterapier med mRNA lipid nanopartikler til overførbare blodplader
Blodpladetransfusioner er essentielle til at håndtere blødninger og hæmostatisk dysfunktion og kan udvides til at blive brugt som celleterapi for en række sygdomme. Bestræbelserne på at skabe sådanne celleterapier kræver, at forskere modificerer donorblodplader til at udtrykke terapeutiske proteiner. Men på nuværende tidspunkt er passende metoder til genetisk modificering af blodplader indsamlet fra bloddonorer stadig uhåndgribelige.
I en ny undersøgelse offentliggjort i Science Advances , Jerry Leung og et team af forskere inden for nanomedicin, biokemi og molekylærbiologi ved University of British Columbia, Canada, Hokkaido University, Japan og forskellige institutioner i USA, beskrev en tilgang baseret på blodpladeoptimerede lipidnanopartikler indeholdende mRNA for eksogen proteinekspression i blodplader hos mennesker og rotter.
Da holdet testede biblioteket af mRNA-lipid nanopartikler, korrelerede den resulterende eksogene proteinekspression ikke med blodpladeaktivering. De transficerede blodplader bibeholdt hæmostatisk funktion og akkumulerede i områder med vaskulær skade efter transfusion til rotter med kapacitet til at udvide det terapeutiske potentiale af blodpladerne.
Blodplader og hæmostase
Blodplader er en integreret del af hæmostase og transfunderes rutinemæssigt for at genoprette hæmostatisk balance hos patienter. Disse blodplader kan udvides ud over indikationer som celleterapier til behandling af sepsis, betændelse og gigt. Genetisk modificerede blodplader kan skabe nye celleterapier, der udtrykker terapeutiske proteiner, som kan implementeres til at modificere donorblodplader. Eksisterende metoder til elektroporering, virale vektorer og kommerciel transfektion har ikke været i stand til at redigere donorblodplader og udtrykke eksogene proteiner.
Indirekte tilgange kan udtrykke eksogene proteiner i blodplader eller blodpladelignende partikler ved at målrette blodpladeprecursor-stamceller med lentivirale vektorer. De donorafledte blodplader skal modificeres funktionelt for at skabe autentiske blodpladecelleterapier.
Tidligere forsøg på at transficere blodplader med lipid-nanopartikler indeholdende mRNA har vist muligheden for mRNA-levering til blodpladerne, mens fremskridt inden for lipid-nanopartikelteknologi har forbedret dets potentiale til at nå en bredere demografi.
I dette arbejde rapporterede Leung og kolleger om mRNA-lipidnanopartikler for deres evne til direkte at transficere donorblodplader for at udtrykke eksogene proteiner. Sådanne blodplader kan modificeres med mRNA-lipidnanopartikler for at opretholde deres funktion og akkumulere lokalt i sår og regulere homeostase efter transfusion i koagulopatiske rotter.
Lipidnanopartikler letter eksogen proteinekspression i blodplader
For at identificere de effektive transfektionsmetoder for blodplader leverede teamet mRNA, der koder for et enzym NanoLuc luciferase (NanoLuc) ved hjælp af flere transfektionsmidler og målte deres ekspression. Mens NanoLuc var uopdaget i blodplader behandlet med frit mRNA uden et transfektionsmiddel eller ved at bruge kommercielle mRNA-leveringsmidler, tillod processen optagelsen af store mængder mRNA i blodpladerne.
Leung og team detekterede NanoLuc-ekspression ved at bruge en mRNA-lipid-nanopartikelformulering, der lignede den lille interfererende RNA-lipid-nanopartikel, der er klinisk bevist til at behandle arvelig amyloidose. Holdet sammenlignede mængden af blodpladeaktivering efter mRNA-lipid-nanopartikeltransfektion med ubehandlede blodplader.
For at identificere den mRNA-lipid nanopartikelformulering, der er bedst egnet til at transportere blodplader, optimerede de tre hovedkomponenter; ioniserbare lipider, linkerlipider og polyethylenglycollipidet. De screenede 10 ioniserbare og to permanent kationiske lipider og målte deres proteinekspression, mRNA-optagelse og aktivering for at understøtte proteinsyntesen.
Handlinger af de funktionaliserede lipidnanopartikler i laboratoriet
For at undersøge, hvordan kombinationen af ioniserbare og hjælpelipider har synergistiske virkninger for at forbedre proteinekspression og samtidig minimere blodpladeaktivering, studerede holdet to FDA-godkendte ioniserbare lipider. Bortset fra deres lipidsammensætning spillede mRNA-elementerne en væsentlig rolle for at fremme effektiv eksogen proteinsyntese. Lipidnanopartiklerne, der indeholdt hjælpelipider med et fosfocholinhoved, sammen med lipider med forgrenede eller umættede halegrupper, var bedst egnede til blodpladetransfektion og til at drive højere ekspressionsniveauer.
Af de RNA-modifikationer, der blev testet i dette arbejde, bemærkede Leung og kolleger umodificeret uridin eller pseudouridin for at lette højere ekspressionsniveauer af fluorescens. De observerede derefter, om ekspressionen af fluorescens afhang af graden af blodpladeaktivering eller af mængden af afgivet RNA, som de undersøgte ved hjælp af en korrelationsmatrixanalyse.
Mens fluorescensekspressionen ikke var stærkt korreleret med overfladepladeniveauer eller mRNA-optagelse, noterede de en mild positiv korrelation mellem mængden af afgivet RNA og blodpladeaktivering. Da NanoLuc-ekspression ikke var stærkt korreleret med hverken overfladeblodpladeniveauer eller mRNA-optagelse, testede holdet muligheden for at påvirke dets ekspression ved at aktivere blodplader ved hjælp af agonister før og efter mRNA-lipid-nanopartikeltransfektion.
Brodpladebehandling for at modellere fortyndet koagulopati
Blodplader stimuleret med adenosindiphosphat, for eksempel tværbundet kollagenrelateret peptid eller thrombin før mRNA-lipid nanopartikelbehandlingen, havde signifikant mindre fluorescensekspression. Da Leung og teamet stimulerede blodplader med agonister i mere end to timer, gennemgik de en væsentlig omlejring af transkriptomet og proteomet. Resultaterne viste, at translationen af eksogent mRNA ikke krævede blodpladeaktivering.
Når holdet behandlede blodplader med mRNA lipid nanopartikler, opretholdt de hæmostatisk funktion in vitro og viste høj følsomhed over for deres fysiske og kemiske miljøer. Holdet undersøgte, om blodpladerne stadig kunne aktiveres efter mRNA-lipid nanopartikeltransfektion og målte deres aktiveringstilstand og respons på fysiologiske agonister.
Holdet testede kapaciteten af transficerede blodplader til at bevare deres potentiale til at bidrage til fastheden og hastigheden af koageldannelse ved hjælp af en model for rotationstromboelastometri og en ex vivo-model til at teste blodpladeaktivitet i fuldblod. Forskerne modellerede fortyndet koagulopati ved hjælp af fortyndet fuldblod og forberedte blodplader i en transfusionspakke.
Da de kombinerede transfusionspakken med fortyndet fuldblod for at modellere sygdommen, som den opstår hos en patient, bemærkede de, at lipidnanopartiklerne ikke påvirkede blodpladekoagulopati in vitro. Derudover undersøgte holdet ekspressionen af blodplader transficeret med mRNA-lipidnanopartikler udtrykt med NanoLuc, cirkuleret og lokaliseret til sårsteder efter transfusion til koagulopatiske gnavere.
Outlook
På denne måde målrettede Jerry Leung og kolleger leveringen af molekyler og celleterapier til vaskulaturesteder af interesse ved at bruge de naturligt kompetente blodplader, der i sagens natur kan udføre denne opgave. Holdet udviklede blodpladeoptimerede lipidnanopartikler og mRNA til vellykket proteinekspression, mens de præsenterede trombocytcirkulær funktion og lokal akkumulering på det interesserede vaskulatursted.
Det er muligt at opnå levering af nukleinsyrer og eksogen translation ved hjælp af blodpladeoptimerede mRNA-lipid nanopartikler til at udvide og konstruere blodplader til en række forskellige kliniske anvendelser. Sådanne donorblodplader konstrueret med mRNA-lipid nanopartikler kan behandle akutte blødningsforstyrrelser med bredere anvendelser inden for onkologi. Disse blodplader, der er transfunderet med optimerede mRNA-lipid-nanopartikler, er funktionelt transfuserbare og kan akkumuleres på vaskulaturstedet til effektive blodpladebehandlinger til at modulere hæmatologiske lidelser.
Flere oplysninger: Jerry Leung et al., gensplejsede transfuserbare blodplader ved hjælp af mRNA lipid nanopartikler, Science Advances (2023). DOI:10.1126/sciadv.adi0508
Journaloplysninger: Videnskabelige fremskridt
© 2023 Science X Network
Varme artikler
-
Strækning af enkeltmolekyler muliggør præcisionsstudier af interagerende elektronerEt scanningselektronmikrograf af en guldbro suspenderet 40 nanometer over et siliciumsubstrat. I forsøget, broen er afskåret i midten, et enkelt molekyle er suspenderet hen over hullet, og substratet -
Forskere opdager selvsamlende 2-D og 3-D materialer2D hexagonale arklignende og 3D kapsidstrukturer baseret på atomisk præcise guldnanocluster, styret af hydrogenbinding mellem liganderne. Indsatsen i øverste venstre hjørne viser atomstrukturen af e -
Kobber -nanotråde Aktiver bøjelige skærme, SolcellerSmå kobbertråde kan bygges i løs vægt og derefter printes på en overflade for at lede strøm, gennemsigtigt. Benjamin Wiley, Duke Chemistry (PhysOrg.com) - Et team af kemikere fra Duke University h -
Forskere undersøger de fulde termoelektriske egenskaber af et enkelt molekyleKredit:Pixabay/CC0 Public Domain En af fysikeres drømme i dag er at kunne høste elektricitet tilbage fra afledt varme. Nøglen til dette ligger sandsynligvis i kredsløb, der indeholder enkelte mole